Микрофлюидных устройство для изучения нескольких различных штаммов

Общая цель данного метода состоит в том, чтобы изобразить поведение отдельных клеток из разных штаммов дрожжей в одних и тех же динамических условиях. Это достигается путем изготовления двухслойного микрофлюидного устройства, в противном случае нижний слой будет содержать каждую из различных деформаций отдельно, а верхний слой будет обеспечивать условия динамического потока в качестве второго этапа. В лунки помещают различные штаммы дрожжей и закрывают устройство, создавая единый канал с несколькими разделенными штаммами.

Затем мы визуализируем реакцию клеток на динамические изменения среды Контролируя скорость потока на двух входах Y-канала, результаты показывают различные деформации, подверженные воздействию одних и тех же динамических условий, и отсутствие перекрестного загрязнения между скважинами. Это микрофлюидное устройство имеет несколько ключевых преимуществ перед другими существующими системами. Это позволяет визуализировать несколько различных штаммов в одних и тех же динамических условиях.

Кроме того, что немаловажно, его можно легко изготовить в любой лаборатории без необходимости в специальном оборудовании. Этот метод возник в результате обсуждения того, как проследить реакцию различных изолятов Дикого Востока на голодные пассы. Запустите, нарисуйте или распечатайте желаемый макет микроканала для масштабирования.

Далее накройте стеклянное стекло слоями скотча Чтобы добиться нужной высоты канала, разместите макет на плоской поверхности и выровняйте слайд по шаблону дизайна. Теперь аккуратно разрежьте ленту на стекле предметного стекла согласно макету. Снимите скотч со всех участков предметного стекла.

Принимайте те, которые находятся в раскладке микроканала. Поместите горку в духовку с температурой 65 градусов Цельсия на три минуты. Затем аккуратно очистите этанолом.

Смешайте базовые и отверждающие компоненты PDMS в соответствии с рекомендациями производителя. Налейте около 30 миллилитров смеси PDMS в чашку Петри на высоту примерно 0,5 сантиметра. При необходимости дегазируйте PDMS в вакууме.

Погрузите предметное стекло в PDMS скотчем с рисунком вверх. Размещение рисунка после PDMS предотвращает образование пузырьков воздуха между предметным стеклом и чашкой Донное отверждение в течение 48 часов при температуре 65 градусов Цельсия, при этом блюдо находится в горизонтальном положении с помощью уровня пузырьков в новой 90-миллиметровой чашке Петри. Залейте три миллилитра смеси PDMS.

Этот шаг можно сделать на спин-кодере, если он доступен. DGA и лечить, как показано ранее. Теперь аккуратно вырежьте проточный слой микрофлюидного устройства до нужного размера с помощью дырокола для биопсии.

Создайте отверстия для входных и выпускных отверстий в проточном слое. Также вырежьте аналогичный по размеру слой лунок из второй чашки Петри и выложите на толстый стакан. Проведите пальцем по макету дизайна.

Затем выбейте лунки в соответствии с микроканалами на макете с помощью этанола, очистите оба слоя PDMS и стеклянную крышку и высушите на воздухе. Затем обработайте стеклозащитное стекло и луночный слой PDMS либо стандартным плазменным травлением для необратимого склеивания, либо ручным коронным протравителем для обратимого склеивания. Аккуратно положите лунки слоем поверх крышки стекла, чтобы вызвать адгезию.

Аккуратно разотрите все пузырьки воздуха. Приготовьте нужную среду в соответствующих шприцах и подсоедините к тигону трубку, продетую через шприцевой насос. Для визуализации клеток.

Используйте сильные стороны. Перейдите к нужной фазе, тщательно обработайте культуру вихрем и перелейте 300 микролитров в микроцентрифужные пробирки. Аккуратно поместите по одному микролитру con canna A в каждую лунку слоя лунок PDMS.

Дважды смойте излишки конны А из каждой лунки, осторожно пипетируя воду, пока кон в А высыхает. Дважды промойте штаммы 300 микролитрами среды СК, в которой отсутствует глюкоза. Вымывание остаточной глюкозы с клеточных стенок способствует правильному прилеганию к конвалу.

После вортексирования клетки тщательно пипетируют примерно 0,5 микролитра клеточной суспензии в отдельные лунки. Аккуратно промойте остатки клеток насыщенной средой. Следующие два шага нужно выполнить быстро, чтобы предотвратить высыхание клеток.

В качестве дополнительной ступенчатой плазмы обрабатывайте чип и скважины, стараясь не попасть непосредственно в скважины. Затем под стереоскопом осторожно поместите чип на лунки, уделяя пристальное внимание выравниванию между ними. Аккуратно прижмите, чтобы приклеить два слоя PDMS.

Медленно полностью заполните устройство примерно 50 микролитрами насыщенной среды, следя за тем, чтобы внутри канала не осталось пузырьков воздуха. Теперь подключите устройство, вставив трубки в соответствующие входные отверстия, и запустите поток среды. Следите за тем, чтобы в трубке не образовывались пузырьки воздуха, так как они могут застрять в устройстве и нарушить поток.

Поместите устройство под микроскоп и найдите соответствующие точки визуализации в каждой из них. Хорошо держите клетки под богатым средним потоком в течение одного часа или дольше, если это необходимо. Чтобы обеспечить восстановление.

Начните эксперимент с настройкой постоянного потока. Сцеживайте насос A до 0,8 миллилитра в час, а насос B до 0,2 миллилитра в час. Для среднего расхода свыше 80% ширины канала.

Мы можем динамически изменять условия в устройстве, изменяя относительные скорости потока. Новые условия стабилизируются в течение нескольких секунд по всему каналу, чтобы продемонстрировать разделение между различными штаммами. Два различимых штамма дрожжей визуализированы в чередующихся лунках.

Обратите внимание, что в этом эксперименте не происходит утечки ячеек между лунками. Оба штамма имеют фактор транскрипции MSN two, помеченный YFP для проверки одновременного эффекта динамически изменяющихся условий. Скорость потока в двух входных каналах была изменена для создания ступени отсутствия глюкозной среды.

Это привело к локализации MSN 2 в ядре. Важно отметить, что можно анализировать временной трек двух уровней YFP в отдельных клетках ядерного MSN. Таким образом, микрофлюидное устройство PDMS может быть использовано для применения параллельных динамических условий к нескольким скважинам.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что нельзя допускать высыхания клеток во время сборки устройства. Как только вы освоите эту технику, ее можно будет легко выполнить без необходимости в мягкой литографии.