Кремний Микрочипы для манипулирования межклеточных Взаимодействие

Здравствуйте, меня зовут Эллиот Ху. Я являюсь научным сотрудником в лаборатории Тиа здесь, в Массачусетском технологическом институте. Сегодня мы будем готовить клеточные культуры на кремниевых микромеханических чипах. Устройства выглядят как маленькие гребни, которые смыкаются вместе, и они позволяют нам точно манипулировать взаимодействием между двумя различными популяциями клеток.

Сегодня мы будем изучать взаимодействие между гепатоцитами печени и поддерживающими стромальными клетками. В частности, три клетки фибробластов Т-3 культивируются на верхней поверхности сот, так что, перемещая пальцы гребня, вы можете перемещать клетки и изменять их пространственное расположение. Каждое устройство разделено на две части, которые соединяются друг с другом в двух возможных конфигурациях.

Первый приводит две клеточные популяции в контакт друг с другом. Второй немного разделяет две популяции так, что клетки не могут соприкасаться. Здесь контактные взаимодействия предотвращаются, но сохраняются взаимодействия через секретируемые Факторы.

Начнем с разговора о том, как правильно обрабатывать детали с помощью пинцета. Мне нравится использовать как большие тефлоновые пинцеты, так и меньшие металлические пинцеты с круглым кончиком. С помощью большего пинцета вы можете захватывать детали по краям, например, с большими частями с руками, вы должны быть осторожны, чтобы не сломать руки, потому что они очень хрупкие.

Итак, вы хотите подобрать их в задней части детали вот так. С помощью металлического пинцета вы можете залезть в отверстие и забрать стружку напрямую. Более крупные части будут помещаться в стенку 12-луночной пластины, в то время как меньшие части будут помещаться либо в 24-луночную пластину, либо могут быть соединены с большей частью.

В 12-луночной пластине я обычно использую металлический пинцет. Когда я беру в руки детали в пластинах, чтобы соединить две части вместе, обычно я сначала помещаю большую часть в лунку и толкаю ее до упора в одну сторону. Затем я беру бесплатный ремонт и ставлю его на другую сторону колодца, и я сталкиваю их вместе, вставляя два пинцета, по одному в каждое отверстие.

Так что теперь я могу просто зафиксировать детали вместе, либо в конфигурации с зазором, либо в конфигурации контакта. Если я хочу разобрать детали, мне нравится тянуть детали до конфигурации зазора, а затем тянуть вертикально вверх, чтобы снять деталь. Теперь устройства изготовлены из кремния, поэтому они должны быть покрыты, чтобы обеспечить надлежащую адгезию ячеек.

Вы, вероятно, получите устройства, уже покрытые полистиролом и обработанные плазмой, поэтому мы предполагаем, что это наша отправная точка. Прежде всего, мы собираемся использовать коллаген для покрытия поверхности, к которой будут прикрепляться гепатоциты. Мы поместим в гепатоцитарные гребни коллаген с концентрацией 50 микрограммов на миллу, один раствор и будем инкубировать при температуре 37 °C в течение 45 минут.

С другой стороны, гребни фибробластов нам не нужно покрывать. После инкубации мы отсасываем раствор коллагена и промываем водой. Теперь мы собираемся зафиксировать ES вместе в контакте с дополнительными деталями, чтобы сформировать плоскую поверхность для засева ячеек.

Сначала мы заполним несколько лунок 70% этанолом. Я положу по паре в каждую лунку, а затем зафиксирую их вместе. После сплочения мы хотим посмотреть на детали под микроскопом, чтобы убедиться, что они компланарные.

Время от времени детали могут смещаться друг с другом. И на микроскопе вы увидите, что они находятся в двух разных фокальных плоскостях. В этом случае просто разделите детали и сдвиньте их вместе Убедившись, что выравнивание в порядке, мы даем деталям постоять в этаноле некоторое время для стерилизации.

Часто я тороплюсь, поэтому просто замачиваю на 10 минут. После стерилизации нам нужно промыть. Этанол тщательно отсасывайте и промойте в воде, затем аспирируйте и снова промойте в воде, и, наконец, аспирируйте воду и замените ее на вашу питательную среду.

Теперь давайте засеем клетки на устройства. Как правило, мы суспендируем клетки в концентрации 500 000 клеток на миллилитр, и пипетируем одну миллилитровую суспензию над каждой парой гребней с помощью 12-луночного планшета. Поэтому мы засеяли фибробласты в концентрации 500 000 клеток на миллилитр в двух лунках.

Точно так же мы взяли суспензию в 500 000 гепатоцитов на лунку и засеяли их в две другие лунки. Теперь, перед инкубацией, мы тщательно встряхнем клетки, чтобы убедиться, что они равномерно распределены. А мне нравится встряхивать три раза по вертикали, три раза по горизонтали, а потом повторять это три раза.

После встряхивания мы поместим его в инкубатор и дадим клеткам постоять 15 минут, после чего мы снова встряхнем их. После встряхивания каждые 15 минут в течение часа, мы собираемся затем отсасывать клеточную суспензию и играть на новой суспензии клеток. И мы будем повторять это до тех пор, пока у нас не получится сливающийся слой клеток.

Как правило, при фибробластах требуется одно или два сидения. А с гепатоцитами он может занимать от двух до четырех посадок. Чтобы получить сливающийся монослой, клетки рассаживают с достаточно высокой плотностью, встряхивая, следит за тем, чтобы клетки распределились равномерно.

После первой рассадки образуется разреженный слой клеток. Обратите внимание, что клетки прикрепляются только к пальцам, покрытым полистиролом и коллагеном. После посева свежих клеток и инкубации еще час, опять же с встряхиванием каждые 15 минут, слой клеток становится плотнее.

После третьего посева у нас хорошая плотность клеток, и теперь мы можем остановиться после того, как клетки были посеяны на соты. Мы хотим манипулировать клетками в желаемой экспериментальной конфигурации. Теперь устройства отделяются от своих комплементарных частей и инкубируются в течение 24 часов.

Через 24 часа клетки распространяются, образуя сливающийся монослой по поверхности сот. Теперь мы хотим сформировать сокультуру. Теперь гребень гепатоцитов и гребень фибробластов переносятся в одну лунку и фиксируются вместе в желаемой исходной конфигурации.

При желании. По прошествии определенного количества времени вы можете изменить конфигурацию. Например, мы можем перейти к конфигурации зазора через 18 часов, детали помещаются в одну и ту же конфигурацию, хорошо прижимаются друг к другу до тех пор, пока не будет достигнута конфигурация зазора, а затем соприкасаются обратно в конфигурацию зазора.

А теперь мы удалим одну расческу. Что мы собираемся сделать сейчас, так это пройти через процесс снятия старого покрытия из полистирола, очистки от чипов, а затем нанесения нового полистирольного покрытия и подготовки его к культивированию клеток. Опять же, сняв старое полистирольное покрытие и нанеся новое покрытие, мы гарантируем, что ничто из истории предыдущего эксперимента не помешает новому эксперименту.

Итак, после того, как вы закончите свой эксперимент, первое, что вы хотите сделать, это отбелить клетки, а затем смыть расчески и воду. Поэтому, прежде чем положить чипсы в подносок, вы должны убедиться, что они полностью высохли. Итак, у нас есть несколько расчесок, которые я только что оставила сушиться на воздухе на некоторое время и проверить, полностью ли они высохли.

И теперь мы возьмем немного пальцев и поместим их в эту стеклянную колонку. Здесь мы будем использовать стеклянную пипетку, чтобы мы не растворили ее. На Хэллоуин пластик растворяется, поэтому мы не можем использовать обычную полистирольную пипетку.

Ладно, хватит. А теперь мы просто возьмем пару этих частей, поместим их в носок, и я собираюсь включить шейкер для взбалтывания, и мы накроем его алюминиевой фольгой, чтобы толуол не испарился. Таким образом, через два часа толуол должен растворить большую часть полистирола на гребнях, и мы можем просто вытащить их и высушить на воздухе.

После полоскания на Хэллоуин детали должны быть относительно свободны от полистирола и должны быть относительно чистыми. Тем не менее, нам нужно, чтобы детали были предельно чистыми, чтобы новый слой полистирола сформировал хорошую адгезию, если они не очень чистые. Поли имеет тенденцию отслаиваться в середине эксперимента, когда клетки начинают его тянуть.

Итак, то, что мы сейчас собираемся сделать, это чистка от пираний кислотой. Я вставил детали в стеклянную колонку, и мы собираемся нагреть ее. Итак, мы поставим горячую плиту.

А здесь у нас есть серная кислота и перекись водорода. Сначала я собираюсь налить серную кислоту, а здесь убедитесь, что вся стружка погружена под жидкость. Иногда они имеют тенденцию к плаванию.

И теперь, когда мы работаем с довольно агрессивными химическими веществами, убедитесь, что вы носите правильное защитное снаряжение. Здесь. На мне нитриловые перчатки. Теперь мы добавим перекись водорода в кислоту и будем осторожны, потому что это экзотермическая реакция.

Вы можете видеть, что он немного дымится во время реакции, но мы хотим добавить немного энергии в систему, чтобы сделать ее еще более реактивной. Итак, теперь мы собираемся нагреть его до 120 градусов по Цельсию примерно на 20 градусов, так что вы можете быть уверены, что любые остатки вашей клеточной культуры будут полностью очищены от ваших чипов. Таким образом, на этом этапе вам нужно просто позволить реакции идти полным ходом, пока вся перекись водорода не будет израсходована.

И в этот момент смесь перестанет пузыриться. Таким образом, реакция протекает примерно за полчаса. А после того, как вы перестанете видеть пузырьки, вы можете просто выключить конфорку и дать ей остыть.

И мы собираемся перенести их в воду с кривой BAK. И еще раз, убедитесь, что вы используете тефлоновый пинцет, а не металлический, и вы можете просто взять их и перенести. Итак, теперь мы просто собираемся промыть его под постоянным потоком DDH, два O. Я обычно беру его прямо из Meine, и мы оставляем его работать как минимум на 10 минут.

И тем самым мы смыем все следы кислоты после измельчения под струей воды в течение 10 минут. Кислота должна быть удалена из стружки, и мы будем просто хранить ее под водой до того времени, когда мы будем готовы покрыть полистирол 45 000 молекулярной массы, который мы получили от Sigma. И мы собираемся взвесить небольшую его часть здесь.

У нас есть 400 миллиграммов, и мы собираемся растворить их в толуоле в соотношении 100 миллиграммов на миллилитр. Так что толуол нужно обрабатывать в вытяжке. И еще одна вещь заключается в том, что поскольку мы собираемся использовать толуол для растворения полистирола, мы хотим убедиться, что мы не используем лабораторную одежду, сделанную из полистирола.

Здесь мы используем полипропиленовый, конический и стеклянный пипетку. Так как у меня есть 400 миллиграммов полистирола, я собираюсь добавить четыре миллилитра полистирола. И теперь мы будем делать его вихрем в течение получаса, пока полистирин не растворится. Итак, теперь мы просто будем вращать трубку на самой низкой скорости от 20 минут до получаса.

Итак, я собираюсь прикрепить трубку к вихрям. Мне не нужно держать его там все время. Через 20-30 минут полистирол должен раствориться, и мы готовы нанести на него покрытие.

Теперь мы собираемся нанести прядильное покрытие на полистирол на нашем предприятии. Наш спин-кодер находится в чистом помещении. И здесь мы должны надеть кепку, очки, халат, пинетки и перчатки, но это может быть не так в вашем учреждении.

Прежде чем мы начнем использовать этот патрон, я хочу защитить его от полистирола. Итак, мы собираемся покрыть его алюминиевой фольгой, и мы хотим сделать его как можно более плоским к поверхности, чтобы чип мог сидеть заподлицо с поверхностью. Мы собираемся проделать небольшое отверстие прямо в центре, чтобы мы могли поддерживать вакуум на чипе.

Спин-кодер установлен на 2, 400 об/мин и 30 секунд. Теперь мы можем взять одну из наших стружек, поместить ее так, чтобы центр чипа закрывал отверстие, и я сначала отключу вакуум, когда надену полистирол, включим пылесос, а затем начну вращение. Таким образом, для более мелких деталей мы можем нанести чуть меньше 10 капель.

А для более крупных деталей требуется чуть больше 10 капель полистирола. И мы будем вращать его в течение 30 секунд со скоростью 2 400 оборотов в минуту. Теперь мы возьмем чипсы, покрытые полистиролом, и поместим их в духовку при температуре 120 градусов по Цельсию. Это выше точки стеклянного перехода полистирола.

Таким образом, он будет оплавлять поверхность, чтобы немного сгладить ее, а также уплотнять и затвердевать пластик. Поэтому обычно я оставляю его в духовке на ночь. Вероятно, для завершения процесса потребуется не менее нескольких часов.

Таким образом, после ночного запекания чипсы готовы к плазменной обработке. Теперь мы подвергнем полистирол воздействию кислородной плазмы, и это изменит поверхностную энергию так, что белки и клетки будут лучше прилипать к ней. Итак, мы просто загрузим чипы в плазменную камеру и накачаем ее до вакуума.

Хорошей настройкой для использования является 200 мил, тур вакуума и 200 Вт мощности в течение одной минуты под потоком газообразного кислорода. Теперь, когда система откачана, мы собираемся ввести кислород. Хорошо, теперь мы можем включить радиочастотное питание, ударить по плазме на одну минуту.

Поэтому, когда плазма работает, она на самом деле светится. Это как флуоресцентная лампочка. После одной минуты воздействия плазмы мы восстановим давление в атмосфере и сможем вытащить детали.

Теперь детали готовы к белковому покрытию и питанию клеток. Цель разработки этого устройства заключалась в том, чтобы мы могли динамически манипулировать микроархитектурой ткани. Таким образом, микроорганизация тканей в организме, в частности, где клетки расположены по отношению друг к другу, очень важна для определения функции каждой конкретной клетки в лабораторной культуре.

До недавнего времени нам не удавалось хорошо это воспроизвести, но за последние 5 или 10 лет люди научились наносить микросхемы клеток на субстрат тканевой культуры, тем самым помещая клетки именно там, где мы хотим их иметь в планшете для тканевой культуры. И при этом мы смогли открыть некоторые важные аспекты фундаментальной биологии клеточных взаимодействий на микроуровне. До сих пор мы не могли сделать это динамично.

То есть изменить организацию клеточной культуры в середине вашего эксперимента. И это важно, потому что в организме ткань на самом деле не является статичной средой. У нас есть клетки, которые перемещаются и реорганизуются, особенно при заживлении или развитии ран.

Но даже в нормальном органе, находящемся в гомеостазе, много всего движется. Самым сложным техническим аспектом для изучения является то, как физически есть детали. И поначалу, когда вы начнете работать с системой, вас может напугать то, насколько хрупкими являются детали или насколько малы эмоции, которые вам нужно вызвать.

Но я думаю, что если вы просто потренируетесь с ним какое-то время, у вас не должно быть особых проблем. В некоторых местах, где мы видим роль этого устройства, например, в эмбриональном развитии, клетки вступают в контакт с рядом различных клеточных сред по мере того, как клетки почковаются через различные эмбриональные слои. И известно, что взаимодействие с каждым из слоев, когда они вступают в контакт последовательно, подталкивает нас всех дальше по определенному пути дифференцировки.

И поэтому мы думаем, что этот тип устройства может быть хорош для попытки воспроизвести этот тип события в лаборатории. Одним из аспектов микроорганизации, на который мы особенно хотели обратить внимание, была разница между клетками, взаимодействующими посредством контактных взаимодействий, где клеточные мембраны могут соприкасаться друг с другом, и растворимыми факторами, которые выделяются в окружающей среде и диффундируют в клетку, находящуюся немного дальше. И во многих случаях, когда клетки находятся в кокультуре и оказывают влияние друг на друга, было неясно, играют ли эти роли контактные взаимодействия или секретируемые факторы.