Multi-электрод массив записей из нейронов Лавины в органотипической культур

Целью данного эксперимента является изучение самоорганизации здоровой мозговой активности в нейронные лавины, что является отличительной чертой динамики критического состояния в коре головного мозга. Это достигается за счет объединения коронального слоистого среза коры вместе со срезом среднего мозга, который обеспечивает важные для развития дофаминергические входы в кору. В качестве второго шага кокультура среднего мозга коры головного мозга выращивается на многоэлектродной матрице, что позволяет стимулировать многоузловую среду и записывать нейронную активность в культуре.

Затем мы даем сокультуре расплющиться, расшириться и прикрепиться к поверхности MEA в течение первых одной-двух недель в специально разработанном инкубаторе, который циклически перемещает культуру под воздействием обычного воздуха и культуры. Получены результаты работы с флюидами, которые показывают спонтанную самоорганизацию пространственно-временных локальных полевых потенциалов, превращающихся в нейронные лавины. Основано на записях MEA и автономном анализе лавин, который определяет степенной закон в размерах лавин.

Основным преимуществом этой методики перед существующими методами, такими как дисассоциативные культуры, является ее системный, нейронаучный аспект. Мы можем совместно культивировать многие области мозга вместе, и эти многорегиональные культуры создают организацию мозга, которая корректна на больших масштабах, таких как корковые слои и проекционные системы. Применение этого метода выходит за рамки простого изучения нейронных лавин.

Например, мы можем изучать стимул в ответ на сетевом уровне в точно контролируемых условиях in vitro. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как правильное применение плазменной тромбиновой смеси и позиционирование ткани на МЭА трудно освоить. Эти шаги требуют правильного выбора времени, правильного градиента температуры и избегания прямого прикосновения к деликатной поверхности MEA.

Для подготовки стерильной герметичной стеклянной камеры для записи сначала вырезаются резьбовые стеклянные цилиндры с тефлоновым пластиковым колпачком, примерно в двух миллиметрах от дна резьбы. Они необходимы для надежного и плотного закрытия камеры для культивирования. Затем очистите стеклянные кольца, ополоснув их водой три раза, после чего прокипятите в течение пяти минут в этиловом спирте 200-й крепости.

Отложите их в сторону для высыхания силиконового раствора, необходимого для крепления стеклянных колец к поверхности MEA. Используйте защитный кожух ячейки 180 из 4 силиконовых эластомеров и тщательно перемешайте 15 миллилитров частей А и В. Затем посидим 15 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха.

Разделите раствор на один миллилитр Eloqua, и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия впрок. Теперь приклейте стеклянное кольцо к MEA, взяв один миллилитр кремния при температуре 23 градуса Цельсия в шприце с помощью иглы малого калибра и нанеся его на неполированную поверхность стекла. Затем центрируйте стеклянное кольцо на MEA и нанесите дополнительный слой кремния вокруг внешней стороны кольца для более прочного уплотнения.

Дайте этому застыть в течение одного-двух часов при температуре около 60 градусов Цельсия на горячей плите. Затем простерилизуйте камеру MEA и крышки камер под вытяжным колпаком для пластинок, промыв три раза в деионизированной воде, чем три раза 70% спиртом для последнего полоскания. Дайте камере постоять 10 минут в спирте.

После этого подвергните камеру и внутреннюю часть крышки воздействию ультрафиолетового света в течение 10 минут. Автоклав при 120 градусах Цельсия в течение 45 минут. После стерилизации дайте им высохнуть.

Теперь покройте поверхность MEA внутри камеры для культивирования поли-D лизином. Новые мази, использованные в этом эксперименте, являются скорее липофильными, отсюда и покрытые повторяющимися каплями. Аспирация раствора из электродной сетки.

Прикрепите крышку, чтобы запечатать камеру MEA для хранения и дальнейшего использования. Эта процедура дает срезы коры и ОТА примерно для 12 сокультур и должна быть выполнена внутри ламинового колпака в стерильных условиях с использованием здоровых животных через один-два дня после рождения, общее время сбора тканей должно составлять менее одного часа. После обезглавливания начните удаление мозга, сначала сделав два боковых разреза ножницами, чтобы удалить кожу с кожи головы.

Удалите и разрежьте череп тонкими ножницами для глаз, сделав один сагиттальный разрез по средней линии на одном корональном разрезе на стыке коры головного мозга. Откиньте назад все четыре клапана черепа, чтобы обнажить мозг. Далее заточенным шпателем разрежьте фронтально через обонятельную луковицу.

Затем проведите шпателем четверть под мозг. Осторожно поднимите мозг из черепа и позвольте ему скользнуть в холодный взгляд. Решение для быстрого охлаждения и временного хранения.

Повторите описанную выше процедуру еще для двух мозгов. Чтобы получить ткань ВТА, перенесите мозги на стерильную сухую чашку Петри. С помощью небольшого шпателя удалите лишнюю жидкость, осторожно сдвинув каждый мозг в сторону примерно на один сантиметр.

Затем с помощью лезвия бритвы удалите ствол мозга, сделав корональный вертикальный надрез на уровне мозжечка. Теперь приклейте агаровый блок на монтажный диск для механической стабилизации мозга во время процедуры нарезки. Затем нанесите тонкую линию суперклея в нескольких миллиметрах перед агаровым блоком на диске, но избегайте касания клеем агара с помощью небольшого шпателя.

Перенесите и установите каждый лобный полюс мозга вниз. Убедитесь, что фронтальные полюса приклеены к монтажному диску и что подфюзеляжные стороны соприкасаются с агаром без остатков клея. Это обеспечивает надлежащую механическую стабилизацию во время резки и легкий отрыв от нарезанных ломтиков.

Далее осторожно погрузите и закрепите монтажный диск с установленными мозгами в вибрационном лотке, наполненном охлажденным раствором для взгляда. Затем с помощью тщательно очищенного бритвенного лезвия среза корональных срезов среднего мозга толщиной 400 микрометров с самой высокой частотой вибрации и относительно низкой скоростью движения вперед с помощью перевернутой макаронной пипетки с всасывающей колбой соберите и перенесите срезы, содержащие ВТА, в чашки Петри размером 35 на 10 миллиметров, заполненные стерильным охлажденным раствором для глазного мозга для корковых отделов. Повторите предыдущие шаги нарезки, но сделайте вертикальный разрез между корой головного мозга и мозжечком и установите четыре мозга лобным полюсом вверх.

Соберите около трех корональных срезов толщиной 350 микрометров, начиная с уровня стриатума. Теперь с помощью микроножа, сделанного из сломанных бритвенных лезвий, рассеките под стереомикроскопом корональные срезы лобной коры и среднего мозга шириной около двух миллиметров, содержащие VTA. Соберите срез ткани отдельно в небольшую посуду, наполненную охлажденным раствором для взгляда.

Для начала монтажа ткани в камере МЭА необходимо установить камеру МЭА при комнатной температуре под стереомикроскопом с фокусом на электродной решетке. Затем центрируйте каплю плазмы объемом 25 микролитров на чистой, непыльной и стерильной матрице электродной матрицы. С помощью небольшого шпателя осторожно проведите по срезу коры и ВТА в каплю плазмы.

Теперь поместите MEA на охлаждающую пластину и перефокусируйте вид. Дайте ему остыть в течение примерно 15 секунд, прежде чем добавить 25 микролитров тромбина в каплю плазмы. Затем с помощью наконечника пипетки с тромбином осторожно распределите смесь тромбина плазмы небольшими круговыми движениями по МЭА.

Будьте осторожны и не прикасайтесь к хрупкой электродной решетке напрямую. Затем аккуратно расположите кору головного мозга на массиве с дорсальной границей вдоль второго ряда электродов массива. Таким образом, развивающиеся поверхностные слои в конечном итоге покроют оставшуюся часть массива.

Затем поместите ВТА рядом с вентральной границей участка коры головного мозга. Теперь накройте крышкой и неплотно закройте камеру MEA, чтобы сохранить высокую влажность. Дайте сборке культуры MEA постоять около шести минут внутри колпака при комнатной температуре, чтобы обеспечить тромбин плазмы, коагуляцию, приподнятие сознания.

Тем временем повторите процедуру для подготовки еще трех культур. Далее небольшими каплями осторожно добавляют 600 микролитров питательной среды в камеры для культивирования с помощью шприца объемом один куб. см с иглой 25 на пять восьмого калибра. Затем плотно закройте камеру MEA и поместите узел культуры MEA на качающийся лоток для хранения внутри инкубатора.

Через двое суток в пробирке добавьте 10 микролитров ингибитора митоза. Затем обновите питательную среду на 60% через четыре дня in vitro и каждые четыре дня в дальнейшем. Во время нормального роста культура будет значительно сплющиваться и немного расширяться дорсально.

Благодаря развитию поверхностных корковых слоев здоровую культуру идентифицируют по ее непрозрачной сероватой ткани в светлом поле. И наоборот, яркие отражающие везикулы, характерные для мертвых дегенеративных клеток примерно через 10-12 дней после подготовки культур, они готовы к регистрации и стимуляции. Чтобы начать сеанс записи, MEA перемещается из лотка для хранения в столик записывающей головки.

Для записи локального полевого потенциала или LFP используйте полосовой фильтр с частотой от одного до 200 герц. Активность мультиединиц также может быть изучена с помощью полосового фильтра с частотой от 300 до 3000 Гц. Здоровая спонтанная активность, как правило, происходит в виде всплесков различного размера и продолжительности.

Чтобы изучить взаимосвязь между LFP и активностью единицы, мы можем рассчитать средние значения LFP, вызванные всплесками. Для этих культур коры головного мозга отрицательные отклонения LFP коррелируют с нейронными всплесками для регистрации вызванной стимулом активности. Во-первых, временная форма волны и амплитуда стимулов определяются с помощью программного обеспечения, которое управляет генератором стимулов.

Полезной парадигмой стимуляции является одиночный удар с контролируемым током и нейтральным током с биполярной прямоугольной формой волны. Далее выбирается электрод, с помощью которого будут подаваться раздражители. Типичные реакции LFP, вызванные стимулом, похожи на спонтанные всплески активности.

Схема гашения отключает усилители во время стимуляции для уменьшения артефактов стимула и предотвращения насыщения усилителя. Электроду для стимуляции требуется несколько секунд для восстановления после стимуляции, поэтому он не может быть использован для регистрации активности реакции. На MEA имеет тенденцию возникать в пространственно-временных кластерах с активностью на одном электроде, часто сопровождающейся активностью на других участках.

В то же время, типичные формы сигналов LFP в такие периоды активности показаны здесь путем наложения трех кластеров, происходящих с интервалом в несколько секунд для каждого кластера. Отрицательные отклонения LFP можно наблюдать на нескольких электродах в течение одной секунды при извлечении пиков NLFP, которые пересекают порог в несколько отрицательных sd, активность в виде времен пиков NLFP удобно визуализируется в раста, в котором столбцы точек представляют почти совпадающие NPS на различных электродах. Пространственно-временная организация этой деятельности достаточно сложна.

Столбцы, которые кажутся более или менее однородными при низком временном разрешении, состоят из отдельных кластеров при более высоком временном разрешении и т. д. Возникновение космических, геовременных и LFP кластеров высоко организовано в корковых сетях. Если говорить более конкретно, то организация представляет собой масштаб в варианте для нейронных лавин.

Это демонстрируется путем вычисления вероятности размеров кластеров при заданном временном разрешении. Дельта T. Здесь кластеры состоят из NL FPS, которые встречаются в одном и том же или последовательных временных бинах, когда размер такого кластера выражается в общем числе NFPS на кластер или интегрированных NLFP амплитудах на кластер, распределение размеров кластера раскрывает степенной закон с экспонентой, близкой к минус 1,5. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как тщательно препарировать ткани мозга и выращивать культуры на многоэлектродных матрицах, чтобы изучить самоорганизацию нейронной активности.

Эти методы также использовались для изучения взаимосвязи между спонтанной активностью и вызванной стимулом активностью в корковых сетях.