Скрининг клеточной смерти с использованием окрашивания DAPI: метод быстрого скрининга ИК-индуцированной клоногенной гибели клеток в раковых клеточных линиях
JoVE Encyclopedia of Experiments
Исследования рака
0 просмотров • 3:23 мин • April 30th, 2023
Воздействие ионизирующего излучения, такого как рентгеновское излучение, может вызвать повреждение ДНК, что в конечном итоге приведет к гибели клеток. Чтобы проверить влияние ионизирующего излучения на профили гибели клеток, начните с использования чашки для культивирования, содержащей адгезивные раковые клетки, помещенной на поверхность покровного стекла.
Облучайте чашку для культуры рентгеновскими лучами в течение нужной продолжительности. Это лечение вызывает повреждение ДНК внутри клеток. Далее отсасывайте отработанные среды из чашки для культуры и добавляйте подходящий фиксатор. Этот раствор проникает в клетки и фиксирует клеточные компоненты на месте во время последующих этапов окрашивания.
Выбросьте фиксирующий раствор. Снимите покровную крышку, содержащую обработанные рентгеновскими лучами клетки, из чашки для культивирования. Откиньте покровную крышку и поместите ее на поверхность предметного стекла, на которую нанесена капля пятна DAPI таким образом, чтобы элементы находились в прямом контакте с DAPI.
Молекулы DAPI проникают в ядра и связываются с A-T-богатыми сайтами ДНК. Теперь визуализируйте клетки под флуоресцентным микроскопом. Ядра выглядят голубыми и имеют четкую морфологию.
Клетки с конденсированными и фрагментированными ядрами указывают на апоптоз, запрограммированную гибель клеток. Другие, отображающие многолопастные ядра, указывают на то, что клетки переживают митотическую катастрофу. Те, у которых уплощенные ядра показывают множественные яркие пятна, указывают на то, что клетки подвергаются старению.
Возьмите клетки из инкубатора и аспирируйте питательную среду из чашки для культивирования. Отрежьте кончик микропипетки объемом 1000 микролитров примерно в 5 миллиметрах от конца с помощью ножниц и с его помощью добавьте 1 миллилитр раствора для фиксации в чашку для культуры.
Наносите фиксирующий раствор вдоль стенок чашки для культивирования, чтобы свести к минимуму повреждение клеток. Затем переложите эту чашку для культур в квадратную чашку для культуры и осторожно встряхните ее, чтобы равномерно распределить раствор фиксации по покровному стеколу. После этого выдержать блюдо в течение 10 минут при комнатной температуре.
Отсадите фиксирующий раствор из чашки. Теперь добавьте 2 миллилитра PBS вдоль стенок блюда, а затем аспирируйте PBS. Чтобы подготовиться к окрашиванию DAPI, добавьте 5 микролитров реагента для окрашивания DAPI на предметное стекло. Затем снимите покровный лист с посуды с помощью скальпеля и слейте излишки PBS с покровного стекла, коснувшись края покровного стекла бумажным полотенцем.
Теперь установите покровное стекло вверх ногами на каплю окрашивающего реагента DAPI на предметное стекло так, чтобы клетки подвергались воздействию окрашивающего реагента DAPI. Наконец, исследуйте окрашенные клетки под флуоресцентным микроскопом, оснащенным фильтром DAPI.
Обзор
В данной статье исследуется влияние ионизирующего излучения, в частности рентгеновских лучей, на профили гибели раковых клеток. Методология включает облучение адгезивных раковых клеток и анализ возникших повреждений ДНК с помощью флуоресцентной микроскопии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Радиобиология
- Апоптоз
Теоретические сведения
- Ионизирующее излучение может вызывать повреждение ДНК.
- Понимание механизмов гибели клеток имеет решающее значение в исследованиях рака.
- Различная морфология ядер указывает на разные формы гибели клеток.
- Окрашивание DAPI используется для визуализации ДНК в клетках.
Цель исследования
- Изучить влияние рентгеновского облучения на раковые клетки.
- Идентифицировать различные профили гибели клеток с помощью морфологического анализа.
- Использовать окрашивание DAPI для визуализации изменений в ядрах.
Используемые методы
- Облучение культур раковых клеток рентгеновскими лучами.
- Использование фиксаторов для сохранения клеточных структур.
- Окрашивание DAPI для визуализации ядер под флуоресцентным микроскопом.
- Анализ морфологии ядер для определения типа гибели клеток.
Основные результаты
- После облучения в клетках наблюдались отчетливые изменения морфологии ядер.
- Конденсация и фрагментация ядер указывали на апоптоз.
- Наличие многолопастных ядер свидетельствовало о митотической катастрофе.
- Уплощенные ядра с яркими включениями указывали на старение.
Выводы
- Рентгеновское облучение приводит к различным формам гибели раковых клеток.
- Окрашивание DAPI эффективно для оценки изменений в ядрах.
- Понимание этих механизмов может помочь в разработке стратегий лечения рака.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Быстрый морфологический скрининг гибели клеток, индуцированной ионизирующим излучением, позволяет на ранних этапах снизить риски при проверке терапевтических гипотез в процессе поиска новых онкологических препаратов. Связывая воздействие радиации с определенными ядерными фенотипами, данный метод способствует валидации мишеней и пониманию механизмов путей ответа на повреждение ДНК. Он представляет собой масштабируемый и воспроизводимый анализ для приоритизации соединений на основе прогностического профилирования гибели клеток.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связывая радиационные повреждения ДНК со специфическими механизмами гибели клеток.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней посредством морфологического подтверждения апоптоза, митотической катастрофы или старения.
- Прогностическая ценность: оптимизирует отбор кандидатов в портфель препаратов, обеспечивая ранние показатели активации путей ответа на повреждение ДНК.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение стандартизированных количественных данных о морфологии ядер, подходящих для рабочих процессов высокопроизводительного скрининга.
- Воспроизводимость: протокол фиксации и окрашивания гарантирует единообразную визуализацию ядер в различных экспериментах и лабораториях.
- Масштабируемость: совместимость с многолуночными форматами и платформами флуоресцентной микроскопии для скрининга библиотек соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: позволяет напрямую моделировать ответ раковых клеточных линий на ионизирующее излучение, что способствует проведению доклинических исследований механизмов этого процесса.
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между этапом выявления механизмов в ходе фундаментальных исследований и доклинической валидацией агентов, индуцирующих повреждение ДНК.
- Принятие решений с учетом рисков: позволяет на ранних этапах дифференцировать цитотоксические, цитостатические и индуцирующие старение соединения.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от проверки гипотез о мишенях через идентификацию ведущих соединений до оценки доклинической эффективности, в частности для агентов, повреждающих ДНК, и радиомодификаторов.
- Биология открытий: способствует проверке гипотез путем корреляции радиационного облучения с определенными фенотипами гибели клеток по морфологии ядер.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые результаты окрашивания ядер, готовые для анализа, что позволяет надежно сравнивать эффекты соединений.
- Аналитика: предоставляет количественные показатели морфологии (апоптотические, митотические, сенесцентные ядра), которые позволяют классифицировать механизм действия.
- Трансляционные исследования: связывает ранние этапы изучения механизмов с доклиническими моделями путем валидации ответа на повреждение ДНК в соответствующих раковых системах.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу скрининга на основе флуоресценции для профилирования генотоксичных соединений в различных терапевтических областях.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает уверенность в прогнозах при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в путях гибели клеток.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость скрининга на основе морфологии ядер.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет возможности раннего снижения механистических рисков для кандидатов, индуцирующих повреждение ДНК.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию с учетом рисков на основе механистической точности и фенотипической релевантности.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с культурами клеток, знания в области радиационной безопасности и опыт проведения флуоресцентной микроскопии.
- Необходим доступ к рентгеновскому иррадиатору, фиксаторам, красителю DAPI и флуоресцентному микроскопу с набором фильтров для DAPI.
- Требуется применение стандартизированных протоколов фиксации и монтирования для обеспечения сохранности морфологии ядер.
- При адаптации метода следует учитывать возможность использования различных линий раковых клеток и доз облучения при сохранении стабильности анализа.
- Практические ограничения включают зависимость от качества флуоресцентных изображений и необходимость обучения пользователя методам морфологической классификации.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Обнаружение Inter-хромосомных аберраций Стабильные многократными флюоресценции
Похожие видео
0 Просмотры
Живой клетки микроскопии флуоресцирования соблюдать основные процессы во время роста микробных клеток
Похожие видео
0 Просмотры
Специфический цикл клеток Измерение З2АКС и Апоптоза после генотоксического стресса с помощью цитометрии потока
Похожие видео
0 Просмотры
Измененный Аннексин В / пропидия йодидом Апоптоз Пробирной для точной оценки клеточной смерти
Похожие видео
0 Просмотры
Жить изображений на наркотики Ответы на микроокружение опухоли в мышиных моделях рака молочной железы
Похожие видео
0 Просмотры
Сотовые смерти, связанной с аномальными митоза Наблюдаемые конфокальной микроскопии в живых клетках рака
Похожие видео
0 Просмотры
Одношаговая протокол для оценки режима радиационно индуцированных колониеобразования клеточной смерти по микроскопии флуоресцирования
Похожие видео
0 Просмотры
Создание линий клеток, экспрессирующих DR3 оценить ответ Apoptotic анти митотическая терапии
Похожие видео
0 Просмотры
Автоматизированное дифференциальное ядерное окрашивание анализ для точного определения цитотоксичности митокана
Похожие видео
0 Просмотры
Одновременная визуализация и обнаружение на основе проточной цитометрии множественных флуоресцентных маркеров старения в терапевтических стареющих раковых клетках, вызванных терапией
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026