Скрининг клеточной смерти с использованием окрашивания DAPI: метод быстрого скрининга ИК-индуцированной клоногенной гибели клеток в раковых клеточных линиях

Воздействие ионизирующего излучения, такого как рентгеновское излучение, может вызвать повреждение ДНК, что в конечном итоге приведет к гибели клеток. Чтобы проверить влияние ионизирующего излучения на профили гибели клеток, начните с использования чашки для культивирования, содержащей адгезивные раковые клетки, помещенной на поверхность покровного стекла.

Облучайте чашку для культуры рентгеновскими лучами в течение нужной продолжительности. Это лечение вызывает повреждение ДНК внутри клеток. Далее отсасывайте отработанные среды из чашки для культуры и добавляйте подходящий фиксатор. Этот раствор проникает в клетки и фиксирует клеточные компоненты на месте во время последующих этапов окрашивания.

Выбросьте фиксирующий раствор. Снимите покровную крышку, содержащую обработанные рентгеновскими лучами клетки, из чашки для культивирования. Откиньте покровную крышку и поместите ее на поверхность предметного стекла, на которую нанесена капля пятна DAPI таким образом, чтобы элементы находились в прямом контакте с DAPI.

Молекулы DAPI проникают в ядра и связываются с A-T-богатыми сайтами ДНК. Теперь визуализируйте клетки под флуоресцентным микроскопом. Ядра выглядят голубыми и имеют четкую морфологию.

Клетки с конденсированными и фрагментированными ядрами указывают на апоптоз, запрограммированную гибель клеток. Другие, отображающие многолопастные ядра, указывают на то, что клетки переживают митотическую катастрофу. Те, у которых уплощенные ядра показывают множественные яркие пятна, указывают на то, что клетки подвергаются старению.

Возьмите клетки из инкубатора и аспирируйте питательную среду из чашки для культивирования. Отрежьте кончик микропипетки объемом 1000 микролитров примерно в 5 миллиметрах от конца с помощью ножниц и с его помощью добавьте 1 миллилитр раствора для фиксации в чашку для культуры.

Наносите фиксирующий раствор вдоль стенок чашки для культивирования, чтобы свести к минимуму повреждение клеток. Затем переложите эту чашку для культур в квадратную чашку для культуры и осторожно встряхните ее, чтобы равномерно распределить раствор фиксации по покровному стеколу. После этого выдержать блюдо в течение 10 минут при комнатной температуре.

Отсадите фиксирующий раствор из чашки. Теперь добавьте 2 миллилитра PBS вдоль стенок блюда, а затем аспирируйте PBS. Чтобы подготовиться к окрашиванию DAPI, добавьте 5 микролитров реагента для окрашивания DAPI на предметное стекло. Затем снимите покровный лист с посуды с помощью скальпеля и слейте излишки PBS с покровного стекла, коснувшись края покровного стекла бумажным полотенцем.

Теперь установите покровное стекло вверх ногами на каплю окрашивающего реагента DAPI на предметное стекло так, чтобы клетки подвергались воздействию окрашивающего реагента DAPI. Наконец, исследуйте окрашенные клетки под флуоресцентным микроскопом, оснащенным фильтром DAPI.