Получение клеточных линий для условных нокдаун экспрессии генов и измерения нокдаун влияние на E4orf4-индуцированной гибелью клеток

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы наблюдать влияние нокдауна H ACF one или SNF two на индуцированную E 4 или 4 гибель клеток. Это достигается за счет создания клеточных линий, в которых экспрессия одной или 2 H-сРНК АКФ условно активируется добавлением доксициклина, что приводит к снижению уровня белка АКФ 1 или 2 Н белка ОЯТ в качестве второго этапа. Клетки полученных клеточных линий обрабатывают доксициклином для снижения экспрессии ACF one или SNF two H или оставляют без лечения.

Далее, E 4 или 4 экспрессируется в клетках с или без S-H-R-N-A резистентных ACF one или SNF two H.In для исследования влияния ACF one или SNF two H на E получены четыре или четыре индуцированных результата клеточной гибели, которые показывают влияние уровней ACF one или SNF two H на токсичность E four или 4 на основе подсчета ядер с апоптотической морфологией с использованием анализа JY. Основное преимущество этого метода перед другими методами, такими как транзиторная трансфекция РНК, заключается в том, что все клетки экспрессируют S-H-R-N-A и процент соэкспрессии клеток вместе с традиционной плазмидой выше. Этот метод дает представление о механизмах, лежащих в основе индуцированной гибелью клеток, но он также может быть применен для изучения других белков протозоны.

В дополнение к Ане Лэйф, исследователь из моей лаборатории продемонстрирует части этой процедуры: Чтобы начать процедуру создания индуцируемых клеточных линий пластиной T-Rex 2 9 3 клеток с плотностью примерно от пяти до 10 сантиметров, в восьми миллилитрах DMEM, содержащих сыворотку без тетрациклина и с пятью микрограммами миллилитра бластера в стороне, инкубируйте планшеты в течение ночи при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа на следующий день. Перед трансфекцией замените среду восемью миллилитрами свежей среды. Плазмидой для трансфекции является плазмида P superior neo plus GFP, кодирующая ACF one или SNF two H-S-H-R-N-A, управляемая тетрациклин-индуцируемым промотором Hone, а также ген устойчивости к неомицину, слитый с GFP и управляемый конститутивным промотором PGK.

Добавьте 10 микрограммов плазмидной ДНК к 500 микролитрам 150 миллимолярного хлорида натрия и вортекс. Затем добавьте струйный реактив PY в концентрации два микролитра на микрограмм ДНК в другую пробирку с 500 микролитрами 150 миллимолярного хлорида натрия и вортекс. Добавьте раствор струйного пирога в ДНК и хорошо перемешайте путем вортексирования.

Выдержите его при комнатной температуре в течение 15 минут. Через 15 минут аккуратно нанесите комплексы ДНК на 10-сантиметровые пластины, содержащие от 70 до 80% конфлюенции. T-Rex 2 9 3 ячейки смесь на следующий день.

Замените среду селективной средой в данном примере DMEM, как и раньше, содержащей 500 микрограмм на миллилитр G 18. В течение следующих двух недель следите за клетками. Заменяйте селективную среду аналогичной свежей средой каждые три-четыре дня до появления колоний.

Определите колонии на глаз и отметьте их расположение в нижней части пластины с помощью цветного маркера. Убедитесь под микроскопом, что колонии хорошо разделены. Колонии могут быть изолированы, как только они станут достаточно большими, чтобы их можно было визуализировать без микроскопа.

Для успеха этой процедуры важно выбрать хорошо отделенные колонии во время изоляции колонии. В стерильном капюшоне отсасывайте среду из тарелки. Аккуратно промойте PBS и хорошо отасуньте всю оставшуюся жидкость.

Добавьте три микролитра 0,25% трипсов при ЭДТА в одну колонию на тарелке, поглаживая трипы до тех пор, пока клетки не отделятся от пластины. Переведите клетки в селективную среду в лунку в 24-луночный планшет. Повторите то же самое для нескольких других колоний на пластине.

Выращивайте клетки при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа, пока они не заполнят колодец. Затем разделите клетки из каждой исходной колонии на три лунки, каждая в отдельной 12-луночной пластине, и инкубируйте в течение ночи на следующий день. Замените среду в одной тарелке средой, содержащей один микрограмм на миллилитр доксициклина из исходного раствора, приготовленного в дважды дистиллированной воде.

Замените среду в контрольной пластине на среду без доксициклина. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа в течение 72 часов. Клетки из одной обработанной и одной необработанной лунки затем собирают для вестерн-блоттинга, чтобы определить эффективность ACF one или SNF two H сбитых.

Этот блот был окрашен антителами к SNF, 2 H и альфа-тубулину. Последний выполняет функции управления загрузкой двух клонов. Номера 4 и 5 показали сильное снижение SNF two H при индукции доксициклина и, таким образом, были выбраны для использования в эксперименте по нокдауну, который будет продемонстрирован в следующем сегменте.

Необработанные клетки в третьей пластине будут использованы для расширения выбранной клеточной линии, а аликвоты этих клеток будут впоследствии заморожены. Для дальнейшего использования для индуцирования нокдауна ACF one или SNF двух H-пластин в селективной среде в 10-сантиметровые пластины добавляют доксициклин в концентрации 1 мкг на миллилитр и инкубируют при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа в течение 48-72 часов. Каждая группа планшетов должна обеспечить ячейки для 12 шестисантиметровых пластин, включая два дубликата для анализа DPI для каждой точки, а также по одной пластине для вестерн-блоттинга каждого образца.

Через 48-72 ч после индукции трипсином носом обрабатывают клетки из каждой группы клеток и после их подсчета в 1,5 раза по 10 до шести клеток на шестисантиметровой пластине в ту же среду с доксициклином или без него. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа в течение ночи на следующий день, трансфицируйте клетки. Как указано.

Как необработанные, так и обработанные доксициклином клетки трансфицируются в трех экземплярах четырьмя способами. Один с пустой плазмидой и плазмида, экспрессирующая GFP, два с пустой плазмидой, а также вектор, экспрессирующий устойчивый к SHRA, ACF, один GFP или SNF, два, HGFP, три с плазмидой, кодирующей E четыре или четыре, и плазмида, экспрессирующая GFP, и с плазмидой, кодирующей E, четыре, все четыре. А вектор, экспрессирующий устойчивый к SHRA ACF один GFP или SNF два HGFP после трансфекции, инкубирует все планшеты при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение ночи.

На следующий день после трансфекции клеток извлекают белки из одной пластины в каждом образце для вестерн-блоттинга, чтобы определить, что ACF one или SNF two H были эффективно подавлены, а E 4 или 4 экспрессировались одинаково в разных образцах. Остальные 16 планшетов будут использоваться для анализа DPI. Отсадите среду из планшетов, предназначенных для анализа DPI, и аккуратно промойте клетки PBS в химическом колпаке.

Добавить один миллилитр 4%-ного параформальдегида, приготовленного в PBS, покрыть клетки, инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре без встряхивания. Отсадите параформальдегид и умывайтесь PBS, встряхивая при комнатной температуре в течение пяти минут. Повторите промывку еще два раза, в общей сложности три промывки после третьей промывки PBS при 80% этаноле при температуре минус 20 градусов Цельсия и инкубации при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение как минимум одного часа.

Аспирируйте этанол и промойте клетки дважды с помощью PBS, встряхивая при комнатной температуре в течение пяти минут, каждый раз после этого промойте один раз в течение пяти минут при комнатной температуре PBS, содержащим 0,5% BSA и 0,05% от 20 или P-B-S-B-T. Также с встряхиванием для предотвращения связывания неспецифических антител. Заблокируйте клетки в одном миллилитре буфера P-B-S-B-T, содержащего 10% сыворотки козы, на 20 минут, встряхивая при комнатной температуре.

Затем промойте ячейки дважды в P-B-S-B-T по пять минут на каждую промывку. Инкубируйте клетки с первичным антителом, в данном случае специфическим антителом Е, четырьмя или четырьмя в одном миллилитре P-B-S-B-T в течение одного часа, встряхивая при комнатной температуре. Затем дважды стирайте в P-B-S-B-T и один раз в PBS, содержащем 0,1% BSA, по пять минут при каждой стирке.

Затем добавьте в клетки один миллилитр PBS 0,1% BSA, содержащий соответствующее вторичное флуоресцентно меченное антитело, и 0,5 мкг на миллилитр. Окончательную концентрацию DPI инкубировать в течение 40 минут при встряхивании при комнатной температуре в темноте. Наконец, умойтесь PBS в течение пяти минут.

Высушите лунку методом аспирации и держите пластины вверх дном еще час до ночи для достижения полного высыхания и накройте алюминиевой фольгой крышки крышки слайдов на ячейки с помощью раствора flora Mount G. Держите тарелки при температуре четыре градуса Цельсия в темноте, пока не будете готовы к подсчету. Клетки апоптотических ядер, подвергшиеся различным видам лечения, описанным в протоколе, были зафиксированы и окрашены специфическими антителами Е-4 или 4 и DPI для визуализации ядер трансфицированных клеток.

На этом рисунке показан пример клеток, экспрессирующих E четыре или четыре, а на панели GFP A показана только контрольная экспрессия белка GFP, а на панели B показаны четыре или четыре ядра DAPI с экспрессией DAPI, показанные на панели C, а объединенные изображения показаны на панели D. Белыми стрелками обозначены GFP и E. Четыре или четыре трансфицированные клетки, содержащие ядра с апоптотической морфологией. Красными стрелками отмечены ядра неправильной формы, которые не считаются ядрами апоптоза, звездочкой отмечены митотические ядра или ядра, которые только что разделили количество конденсированных или фрагментированных ядер, визуализированных с помощью DAPI. Подсчет окрашивания проводился для расчета процентного соотношения ядер с апоптотической морфологией в популяции трансфицированных клеток для поддержания оптимальной объективности теста.

Подсчет апоптотических ядер в различных образцах проводился вслепую, при этом подсчет не знал о принадлежности образца. Более высокий процент ядерных аномалий наблюдался в клетках, экспрессирующих Е4 или четыре, что подтверждает, что Т4 или 4 индуцирует гибель клеток. Наибольший процент ядерных аномалий наблюдался в клетках, экспрессирующих Е, четыре или четыре, где уровни ACF 1 снижались с помощью SHR, а опосредованный нокдаун указывал на то, что один нокдаун ACF усиливает токсичность Е 4 или 4.

Экспрессия низких уровней ACF one не была результатом повышения уровня E на четыре или четыре уровня, как это видно при вестерн-блоттинге. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости облегчить подсчет апоптотического ядра с помощью DPI и применять строгие критерии для идентификации этого ядра. В дополнение к этой процедуре могут быть выполнены другие методы, такие как клоногенный анализ, для валидации результатов DA pse После этой процедуры.

Для ответа на дополнительные вопросы могут быть выполнены и другие методы, такие как анализ на соиммунопреципитацию. Например, существует ли физическое взаимодействие между исследуемыми белками.