Обнаружение Inter-хромосомных аберраций Стабильные многократными флюоресценции В Ситу Гибридизация (mFISH) и спектральное кариотипирование (SKY) в облученных мышей

Общая цель этого молекулярно-цитогенного метода заключается в наблюдении межхромосомных стабильных аберраций в клетках костного мозга мышей, подвергшихся тотальному облучению тела. Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области радиационной биологии, такой как риск индуцирования стабильных хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей, подвергшихся тотальному облучению тела. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет визуализировать индуцированные радиацией стабильные генетические повреждения в клетках костного мозга мышей, которые могут распространяться через многие поколения клеток.

После выделения костного мозга из бедренных и большеберцовых костей мыши и изготовления одиночной клеточной суспензии согласно текстовому протоколу, тщательно наложите клеточную суспензию на равный объем среды для разделения мононуклеарных клеток костного мозга. Центрифугируйте градиент при 400 умноженных на G при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем аккуратно соберите охристый слой, не потревожив остальные слои, и перелейте раствор в новую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.

Чтобы приготовить метафазные клеточные спреды, добавьте 10 миллилитров PBS в пробирку, содержащую охристую шерсть. Затем центрифугируйте пробирку при 400-кратном перегрузке при комнатной температуре в течение пяти минут. Далее осторожно извлеките надосадочную жидкость и аккуратно постучите по трубке, чтобы разбить клеточную гранулу.

Затем добавьте 10 миллилитров PBS и снова центрифугируйте суспензию. Удалите надосадочную жидкость, не потревожив клеточную гранулу. Разбейте гранулу и добавьте по каплям четыре миллилитра предварительно подогретого гипотонического 0,075 молярного раствора хлорида калия при легком, постоянном встряхивании.

Инкубируйте клеточную суспензию при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут на водяной бане. Затем добавьте в трубку равное количество фиксатора и аккуратно перемешайте, перевернув трубку. Центрифугируйте пробирку, и удалите надосадочную жидкость.

Затем разбейте клеточную гранулу и добавьте свежий фиксатор. Повторите вращение и добавление фиксатора еще пять раз. После ресуспендирования ячеек в 400-600 микролитрах фиксатора капните 30 микролитров фиксаторов на предварительно очищенные и влажные предметные стекла, наклоненные под углом 45 градусов, и дайте предметным стеклам полностью высохнуть на воздухе в течение ночи.

Для проведения рисования хромосом мыши с помощью mFISH поместите предметное стекло, содержащее метафазные клеточные растечки, в 2X SSC на две минуты при комнатной температуре. Затем обезвоживайте предметное стекло путем серийной промывки этанолом в 70% 80% и 100% этанолом в течение двух минут при каждой стирке. Разогрейте 40 миллилитров денатурационного раствора в стеклянной банке коплина до 70 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Затем перенесите предметное стекло в предварительно подогретый раствор и инкубируйте образец в течение одной-1 1/2 минуты, чтобы денатурировать хромосомы. Немедленно используйте ледяной 70% этанол для охлаждения предметного стекла в течение двух минут, чтобы остановить процесс денатурации и предотвратить повторный отжиг денатурированных хромосом. Затем обезвожьте предметное стекло с помощью этанола, начиная с 80% этанола, в течение двух минут.

Далее поместите предметное стекло в 100% этанол на две минуты. Затем полностью высушите предметное стекло при комнатной температуре. Чтобы денатурировать зонд, кратковременно центрифугируйте смесь зондов, поставляемую производителем, затем перелейте 10 микролитров в 500-микролитровую центрифужную пробирку с защелкивающейся крышкой и инкубируйте пробирку на водяной бане при температуре 80 градусов Цельсия в течение семи минут.

Теперь поместите пробирку с денатурированным зондом на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 10 минут. Затем нанесите зондовую смесь на предметное стекло с денатурированными хромосомами. Осторожно накройте эту область стеклянным покровным стеклом размером 18 на 18 мм и устраните все видимые пузырьки воздуха, очень осторожно прижав покровное стекло к предметному стеклу.

Используйте резиновый цемент для герметизации всех четырех сторон покровного стекла. И инкубируйте предметное стекло в темноте во влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 12-16 часов. После гибридизации осторожно снимите резиновый цемент и покровное стекло и поместите предметное стекло в предварительно нагретую 0,4X SSC при температуре 74 градуса Цельсия на пять минут.

Затем переложите горку в моющий раствор на три минуты. Добавьте на предметное стекло 20 микролитров антивыцветающего монтажного материала с противопятном DAPI и накройте его стеклянным покровным стеклом. С помощью лабораторной папиросной бумаги аккуратно надавите на покровное стекло, чтобы удалить пузырьки воздуха и излишки монтажного раствора.

Затем с помощью лака для ногтей заклейте края покровного стекла. Просматривайте слайды с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного соответствующими фильтрами. Для спектрального кариотипирования хромосом мыши, после гибридизации зондов с денатурированными хромосомами и промывки образцов в соответствии с текстовым протоколом, наносят на предметное стекло 80 микролитров красящего реагента SY5.

Поместите поверх образца пластиковый покровный стекло размером 24 на 60 миллиметров и инкубируйте его в темноте во влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 40 минут. Опустите предметное стекло в стеклянную банку с коплином, содержащую предварительно подогретый раствор для мытья на три минуты и выдержите ее на водяной бане при температуре 45 градусов Цельсия с встряхиванием в течение двух минут. Повторите стирку три раза.

Нанесите на образец 80 микролитров окрашивающего реактива SY5.5, накройте его пластиковым покровным стеклом размером 24 на 60 миллиметров и выдержите в темноте во влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 40 минут. Используйте предварительно подогретый моющий раствор трижды, чтобы вымыть предметное стекло три раза, затем удерживайте предметное стекло в наклонном положении на бумажном полотенце, чтобы слить лишнюю жидкость. Добавьте в образец 20 микролитров реагента DAPI с защитой от выцветания и аккуратно поместите сверху стеклянную защитную крышку, не вводя пузырьков воздуха.

Используйте лак для ногтей, чтобы запечатать края, и наблюдайте за образцом с помощью эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного для съемки изображений неба. На этом рисунке показаны репрезентативные метафазные клеточные разбросы с нормальными и аберрантными парами хромосом мышей первая, вторая и третья. Здесь наблюдается устойчивая аберрация с участием хромосомы, при которой часть первой хромосомы была интегрирована в неокрашенную хромосому DAPI, а другая часть сформировала ацентрический фрагмент.

В этом примере часть второй хромосомы была интегрирована в неокрашенную хромосому. Эта стабильная аберрация включает в себя третью хромосому. В этом метафазном разбросе наблюдаются стабильные аберрации с участием всех трех окрашенных хромосом.

Здесь показан пример спектротипирования нормальной самки мыши. Эта панель представляет собой стабильную аберрацию с участием хромосом 4 и 12. Наконец, стабильная хромосомная аберрация на этой панели включает хромосомы 7 и 10.

После освоения этой техники ее можно выполнить в течение 48-72 часов, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что следует использовать только пролиферирующие клетки. Следование этой процедуре и другим методам, таким как in band, может быть использовано для ответа на дополнительные вопросы, например, присутствуют ли межхромосомные стабильные аберрации в облученных клетках.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области молекулярной цитогенетики к изучению связи между генетическими аберрациями и различными заболеваниями. После просмотра этого видео у вас должно сложиться более четкое представление о том, как определить межхромосомные стабильные аберрации. Не забывайте, что работа с колхицином может быть чрезвычайно опасной, потому что это канцероген, и при проведении этого эксперимента всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток.