CRISPR-опосредованные инструменты редактирования оснований: метод редактирования генома для индуцирования целевой замены оснований

Для CRISPR-опосредованного редактирования генома начните с культуры HAP1-BE3, гаплоидной клеточной линии со встроенным геном BE, кодирующим фермент редактора оснований. К этой культуре добавляют лентивирусные векторы, содержащие плазмиду CRISPR-Cas9, предназначенную для конкретной мишени, такой как ген рака молочной железы человека, BRCA1.

Частица лентивируса сливается с мембраной клетки-хозяина, высвобождая плазмиду, которая в конечном итоге интегрируется в геном клетки-хозяина, образуя сегменты гена CRISPR-Cas9-BE. Эти гены генерируют гРНК, нацеленную на BRCA1, эндонуклеазу Cas9 и BE-цитидиндезаминазу.

ГРНК, нацеленная на BRCA1, представляет собой РНК, которая сливается с Cas9 и направляет комплекс к локусу гена BRCA1. Рядом с этим геном локус представляет собой протоспейсерный смежный мотив, или PAM, где BE может стабильно стыковаться и двигаться вверх по течению, чтобы достичь своей активной каталитической области. Здесь БЭ распознает цитидиновое основание и преобразует его в уридин.

Эта мутация замещения оснований заставляет нуклеазу Cas9 разрезать немодифицированную цепь ДНК. Разрыв нити ДНК активирует ферменты репарации, которые заполняют недостающее основание и превращают у