CRISPR-опосредованные инструменты редактирования оснований: метод редактирования генома для индуцирования целевой замены оснований

Для CRISPR-опосредованного редактирования генома начните с культуры HAP1-BE3, гаплоидной клеточной линии со встроенным геном BE, кодирующим фермент редактора оснований. К этой культуре добавляют лентивирусные векторы, содержащие плазмиду CRISPR-Cas9, предназначенную для конкретной мишени, такой как ген рака молочной железы человека, BRCA1.

Частица лентивируса сливается с мембраной клетки-хозяина, высвобождая плазмиду, которая в конечном итоге интегрируется в геном клетки-хозяина, образуя сегменты гена CRISPR-Cas9-BE. Эти гены генерируют гРНК, нацеленную на BRCA1, эндонуклеазу Cas9 и BE-цитидиндезаминазу.

ГРНК, нацеленная на BRCA1, представляет собой РНК, которая сливается с Cas9 и направляет комплекс к локусу гена BRCA1. Рядом с этим геном локус представляет собой протоспейсерный смежный мотив, или PAM, где BE может стабильно стыковаться и двигаться вверх по течению, чтобы достичь своей активной каталитической области. Здесь БЭ распознает цитидиновое основание и преобразует его в уридин.

Эта мутация замещения оснований заставляет нуклеазу Cas9 разрезать немодифицированную цепь ДНК. Разрыв нити ДНК активирует ферменты репарации, которые заполняют недостающее основание и превращают урацил, не относящееся к ДНК, в тимин. В целом, эти процессы порождают вариант гена.

Теперь инкубируйте клетки в физиологических условиях и субкультуре, чтобы размножить вариант гена. Извлекайте геномную ДНК и секвенируйте ее для анализа эффективности редактирования оснований, опосредованной CRISPR.

За день до трансфекции засейте 5 x 10 5 клеток HAP1-BE3 в лунку в 24-луночные планшеты и культивируйте их до достижения 70-80% конфлекции для трансфекции. Transfect BRCA1-нацеливание направляющих РНК с использованием приобретенных реагентов для трансфекции, в соответствии с протоколом производителя. Используйте 1 микрограмм направляющих РНК BRCA1, чтобы индуцировать конверсию CG в TA в сайтах-мишенях BRCA1. Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и субкультивируйте каждые 3-4 дня. Соберите гранулы клеток через 3, 10 и 24 дня после трансфекции, чтобы проанализировать эффективность редактирования базы. Извлеките геномную ДНК с помощью набора для очистки геномной ДНК.