Трехмерная количественная фазовая визуализация для характеристики подтипов лимфоцитов

Загрузите суспензию подтипа лимфоцитов в камеру визуализации.

Расположите камеру на предметном столике 3D-микроскопа с количественной фазовой визуализацией.

Отрегулируйте параметры микроскопа и фокальную плоскость для оптимального получения изображений.

Во время визуализации лимфоцитов лазерный луч разделяется на эталонный и образцовый лучи.

Цифровое микрозеркальное устройство, оснащенное матрицей микрозеркал на пути луча образца, позволяет лучу вращаться на 360 градусов вокруг оптической оси.

Каждый пучок, проходящий через лимфоцит, подвергается фазовому сдвигу, основанному на изменениях показателя преломления внутри клетки.

Полученный образец и опорные лучи рекомбинируют, образуя 2D-голограмму.

Последовательность голограмм, содержащих информацию о фазе и амплитуде под разными углами, захватывается за счет вращения луча вокруг лимфоцита.

Получение нескольких фоновых голограмм с различными углами освещения, исключая лимфоциты.

Используя алгоритм дифракционной томографии, реконструируйте голограммы в 3D-томограмму с показателем преломления, предоставляя морфологическую и биохимическую информацию о лимфоцитах без необходимости мечения.

Для оптимальной визуализации разбавьте каждый образец клеток до концентрации 180 клеток на микролитр среды RPMI и медленно введите 120 микролитров первого разведенного образца в камеру для визуализации. Убедившись в отсутствии пузырьков в камере, капните каплю дистиллированной воды на линзу объектива 3D-количественного фазового микроскопа и поместите камеру визуализации на ступень для трансляции микроскопа. Отрегулируйте предметный столик так, чтобы образец совпал с линзой объектива, и нажмите «Фокус» и «Поверхность» на вкладке «Калибровка» перспективы микроскопа программного обеспечения для обработки изображений, чтобы отрегулировать осевое положение объектива и линз конденсора соответственно.

Нажмите «Автоматический режим», чтобы выровнять объектив и линзы конденсора. Чтобы оптимизировать выравнивание, откройте режим сканирования и вручную отрегулируйте линзы, чтобы выровнять рисунок цифрового микрозеркала по центру. Затем вернитесь в обычный режим и настройте этап перевода, чтобы найти ячейку в поле зрения. Отрегулируйте осевое положение линзы объектива, чтобы найти фокальную плоскость до тех пор, пока граница образца, визуализированная на экране, не станет практически невидимой.

Важно идеально отрегулировать фокус клетки для генерации оптимальной 3D томограммы RI. Если изображение сделано неправильно, 3D-реконструкция будет нарушена, что приведет к появлению зашумленной томограммы.

Настройте этап перевода, чтобы найти местоположение без ячейки, и нажмите «Калибровать», чтобы измерить несколько 2D-голограмм с различными углами освещения. Настройте этап трансляции так, чтобы ячейка находилась в центре поля зрения, и на вкладке «Получение» присвойте имя образцу, на котором создается изображение.

Нажмите кнопку «3D-снимок», чтобы измерить голограммы ячейки с использованием тех же углов освещения, что и для только что измеренных 2D-голограмм. Когда полученные данные появятся на панели управления данными, щелкните правой кнопкой мыши по данным и выберите «Процесс», чтобы реконструировать 3D-томограмму показателя преломления по 2D-голограммам с использованием алгоритма дифракционной томографии, реализованного в программном обеспечении для обработки изображений. После создания образа, на панели «Управление данными» щелкните правой кнопкой мыши «Данные» и выберите «Открыть», чтобы визуализировать данные.

Щелкните по центру ячейки, чтобы изменить ее положение, и нажмите кнопку Томограмма RI на панели Диспетчер данных. На вкладке Предустановка нажмите кнопку Загрузить и дважды щелкните lymphocytes.xml, которая является предопределенной функцией передачи, предоставляемой программным обеспечением для визуализации томограммы в соответствии с распределениями 3D RI. Прокрутите мышь, чтобы увеличить масштаб, и перетащите ячейку, чтобы повернуть ее в любом направлении.