Обнаружение аномальных прионных белков в тканях мозга с помощью иммуногистохимии

Возьмем слайд с неподвижным участком мозга млекопитающих, демонстрирующим неправильно свернутые агрегаты прионных белков.

Обработайте срез муравьиной кислотой, чтобы снизить инфекционность прионных агрегатов.

Обработайте кислотным буфером внутри гидратированной барокамеры. Высокая температура и кислый pH разрывают индуцированные фиксацией белковые сшивки, демаскируя антигенные эпитопы.

Погрузите в перекись водорода для инактивации эндогенной пероксидазы, предотвращая нежелательное фоновое окрашивание.

Поместите предметное стекло в накладку и добавьте буфер для поддержания увлажнения тканей.

Введите блокирующий раствор, предотвращающий связывание неспецифических антител.

Добавьте первичное антитело, специфичное для агрегатов прионов.

Удалите несвязанные молекулы антител. Введите биотинилированное вторичное антитело, которое связывается с первичным антителом.

Удалите несвязанные молекулы антител. Добавьте фермент биотинилированную пероксидазу в комплексе с авидином, который связывается с биотином на вторичном антителе.

Добавьте хромогенный субстрат, который пероксидаза окисляет в окрашенный продукт.

С помощью микроскопа понаблюдайте за окрашенными агрегатами.

Осторожно погрузите участки ткани в 98% муравьиную кислоту комнатной температуры на 30 минут. Промойте срезы в водопроводной воде в течение 5 минут, после чего дважды промойте в дистиллированной воде. Используйте емкость для окрашивания из нержавеющей стали в барокамере, заполненной 500 миллилитрами дистиллированной воды, для предварительной обработки 10 миллимолярного цитратного буфера при температуре 98 градусов Цельсия в течение 20 минут.

В целях контроля качества поместите на корзину участок клейкой автоклавной индикаторной ленты для контроля температуры и давления. Как только сигнал тревоги укажет, что оборудование достигло заданного времени и температуры, погрузите корзину с горками. Далее запустите программу на барокамере до заданной точки два, и запишите начальное и конечное давление этой программы.

Для инактивации эндогенной пероксидазы необходимо погрузить корзину предметного стекла, содержащую срезы образца, в ванну с 3% перекисью водорода в метаноле на 30 минут. Промойте срезы под проточной водой в течение 5 минут. После слива погрузите срезы в трис-буферный солевой раствор еще на 5 минут. Для иммунодетекции поместите каждое предметное стекло на имеющийся в продаже держатель крышки, предварительно смоченный трис-буферным раствором.

Если сторона ткани обращена к держателю, а края скольжения совпадают с двумя нижними точками держателя, избегайте образования пузырьков воздуха. Удерживайте держатель слайда в сборе между большим и указательным пальцами. Держите один палец в верхней части предметного стекла для образца, а другой — в нижней части держателя. Затем поместите сборку в галерею системы.

Чтобы убедиться, что набор хорошо собран, заполните лунку между предметным стеклом и держателем трис-буферным физиологическим раствором, не переливая его. С этого момента убедитесь, что между держателем и предметным стеклом должно оставаться примерно 80 микролитров Трис-буферного физиологического раствора. Не допускайте высыхания секций.

Уменьшите фоновое окрашивание перед обработкой первичным антителом путем предварительной инкубации образцов предметного стекла в течение 30 минут с 20% нормальной сывороткой того же вида, что и хозяин вторичного антитела, в трис-буферизованном физиологическом растворе. Не промывая срезы, нанесите по 200 микролитров раствора первичного антитела непосредственно в каждую лунку комплекта держателя предметного стекла, и выдержите в течение 60 минут при комнатной температуре.

Чтобы промыть срезы, заполните лунки трис-буферным физиологическим раствором и подождите 5 минут. Повторите стирку дважды. Затем разведите биотинилированное вторичное антитело в концентрации от 1 до 200 в трис-буферном физрастворе с 10% лошадиной сывороткой.

Отремонтируйте необходимый объем, в зависимости от количества обрабатываемых участков. Нанесите по 200 микролитров раствора вторичного антитела на каждую лунку набора держателей предметного стекла. После 30 минут инкубации при комнатной температуре повторите промывку с помощью Триса с буферизацией солевым раствором.

Для инкубации с авидин-биотиновой комплексной пероксидазой приготовьте реагент за 30 минут до применения и нанесите по 200 мкл раствора в каждую лунку держателя слайдовой пластины. После этого инкубируйте установленный держатель тарелки в течение 30 минут при комнатной температуре.