Использование оптической ловушки для изучения хост-Возбудитель Взаимодействие для динамических изображений Живая сотовый

Общая цель данного эксперимента заключается в использовании оптического захвата в сочетании с конфокальной микроскопией вращающегося диска для наблюдения за взаимодействием патогенов с хозяином в режиме реального времени. Это достигается путем предварительного добавления интересующих патогенов в камерное защитное стекло. Затем происходит выбор частицы и ее захват с помощью оптической ловушки.

Наконец, частица направляется к интересующей ее клетке. Как видно здесь. Оптическая ловушка может быть эффективным методом управления двумя частицами для наблюдения за динамическими внутриклеточными взаимодействиями.

Этот метод может ответить на важные вопросы о взаимодействии патогенов хозяина в области инфекционных заболеваний и иммунологии, в том числе о том, каково влияние на фагоцитоз при получении полного контроля пространственных отношений между клетками хозяина и патогенами, а также влияет ли порядок патогенов, поглощаемых фагоцитарной клеткой, на созревание pha somal. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что условия улавливания должны быть оптимизированы для различных типов клеток и гранул. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение в процессе настройки и интеграции вращающегося диска.

Конфокальный по отношению к оптической ловушке трудно концептуализировать из-за точной юстировки, которая необходима для всех оптических компонентов. Соберите интересующий патоген. Например, здесь 300 микролитров канадских альбиканов, выращенных за ночь в бульоне, извлекают из культуры и переносят возбудителей в реакционную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Затем трижды промыть возбудителей при температуре около 1300 G в течение пяти минут при комнатной температуре, отсасывая надосадочную жидкость и оставляя гранулу нетронутой, каждый раз ресуспендируя PBS и сонит. После третьей промывки ресуспендируйте гранулу в 500 микролитрах PBS. Далее растворите один миллиграмм красителя Энтраст в 100 микролитрах диметилформамида до конечной концентрации 10 миллиграмм на миллилитр.

Затем добавьте три микролитра смеси красителя в реакционную пробирку, содержащую промытые возбудители. Поместите фольгу вокруг пробирок, так как красители светочувствительны и встряхните образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа, а затем гранулируйте и промойте образец в PB S3 раза, как и раньше. Повторно суспендируйте гранулу в 300 микролитрах PBS после последней стирки.

Подогрейте среду и нагрейте ПВС до 37 градусов Цельсия на водяной бане. 10-сантиметровый планшет для культуры тканей, покрытый необработанными 2, 6, 4, 0,7 макрофагами два раза, при этом PBS отсасывает PBS между каждым промывкой. Далее накройте поверхность пластины пятью миллилитрами трипсина и выдержите пластину в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем осторожно постучите по боковой стороне пластины, чтобы отделить ячейки от поверхности пластины. Будьте осторожны, чтобы не выплеснуть трипсин за пределы тарелки. Теперь добавьте в тарелку пять миллилитров среды и переложите смесь в реакционную трубку.

После гранулирования клетки отсасывают среду, стараясь не потревожить гранулу, и повторно суспендируют гранулу в 10 миллилитрах среды. Добавьте по 400 микролитров среды в каждую камеру камерного предметного стекла, а затем добавьте по пять микролитров клеточной суспензии в каждую камеру. Дайте клеткам вырасти в течение ночи в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5% CO2.

Извлеките из камерного стекла из пипетки инкубатора от пяти до 10 микролитров заранее подготовленных флуоресцентно меченных патогенов, представляющих интерес, в каждую камеру макрофагов. Тщательно перемешайте макрофаги и патогены, пипетируя вверх и вниз, стараясь не касаться дна камеры и не тревожить прилипшие макрофаги. Включите все составляющие вращающегося диска конфокального микроскопа.

Подготовьте микроскоп, добавив масло в масляную линзу погружного объектива. Вставьте предметное стекло камеры в специализированный предметный столик, а затем снимите верхнюю часть камерного предметного стекла для выравнивания микроскопа для DIC-визуализации. Включите затвор оптической ловушки и ИК-лазера.

Затем откройте затвор на лазере к оптической ловушке. Убедитесь, что затвор перед ИК-лазером закрыт, сверив с помощью ИК-карты. Теперь сосредоточьтесь на макрофагах на прикрепленном предметном стекле.

Затем находят возбудителей, свободно плавающих в растворе рядом с макрофагами. Самой сложной частью этой процедуры является поиск подходящего объекта для отслеживания в камере для образцов из-за сил сцепления между объектом и покровным стеклом в камере для образцов. Чтобы переместить этот объект, вам нужно перемещать сцену, пока объект удерживается транспортным лазером, и также важно отметить, что вы должны перемещать сцену достаточно медленно, чтобы сила сопротивления сцены не превышала максимальную силу захвата ловушкой.

Переместите ступень таким образом, чтобы возбудитель оказался в непосредственной близости от ловушки. Затем откройте затвор и зацепите ловушку. Переместите образец, чтобы привести макрофаги в контакт с неподвижным изображением захваченного патогена.

Патогены с помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском либо во флуоресценции DIC, либо в комбинации обеих отдельных популяций канадских альбиканов, которые обычно имеют размер около пяти микрон, были помечены зеленым, синим и красным. Чтобы проиллюстрировать визуализацию, один C. albicans был захвачен и перемещен квадратным узором через кластер других дрожжей, как указано серыми стрелками, демонстрируя способность захватывать и манипулировать конкретным местоположением одного патогена, выбранного оператором, даже в многолюдной среде. Чтобы еще больше проиллюстрировать гибкость этой системы для улавливания различных морфологий формы, демонстрируемых патогенными организмами на этом рисунке, оптический пинцет был использован для удержания и размещения частицы C albicans с псевдогифи.

C. albicans помечен красным красителем и перемещается по траектории, очерченной белой стрелкой, и помещается рядом с флуоресцентными сырыми клетками GFPL C3. В зеленом цвете. Дрожжевая часть альбиканов была поймана в ловушку, когда псевдо гипхи тянулся за ней.

Aspergillus fum goddess также был помещен рядом с сырой клеткой мышиного макрофага, чтобы проанализировать абсолютные временные рамки фагоцитоза с этой конкретной линией клеток и патогеном. На этом рисунке яркие полевые изображения показывают, как пойманный в ловушку аспергилл, как указано белой стрелкой, был перемещен и расположен вдоль пути, как указано красной стрелкой. Попавший в ловушку патоген немного выходит из фокуса из-за ловушки, выталкивающей организм немного выше фокальной плоскости.

Аспергиллус перемещали до тех пор, пока он не был помещен рядом с желаемой сырой клеткой. Как только патоген вступал в контакт с клеткой, ловушка отключалась. Процесс фагоцитоза был активирован, и для наблюдения за последующими клеточными событиями использовалась покадровая визуализация.

Через 30 секунд мембрана сырой клетки начала изменяться и образовывать чашечку вокруг частицы. Через 60 секунд чашка была полностью сформирована. От 90 секунд до 150 секунд Афу Готти становился и поглощался, а через 180 секунд частица полностью впитывалась.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создать аппарат оптической ловушки с вращающимся диском, и как такой инструмент может позволить неинвазивно контролировать патогены для визуализации живых клеток после его разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области взаимодействия патогенов хозяина к изучению роли пространственных отношений между клетками хозяина и патогенами, а также их роли в последующем иммунном ответе.