Визуализация и количественная оценка белковых агрегатов в мозге генетически модифицированных дрозофил

Начнем с генетически модифицированного мозга дрозофилы. Эти мозги экспрессируют красный флуоресцентный мутантный белок в нейроне, который может распространяться на окружающую глиальную клетку, экспрессируя желтый флуоресцентный нормальный белок, вызывая их агрегацию.

Добавьте фиксирующий раствор, сохраняющий клеточную целостность.

Снимите фиксатор и промойте буфером.

Добавьте реагент против выцветания и инкубируйте, чтобы предотвратить затухание флуоресцентных сигналов.

Перенесите мозги на предметное стекло и удалите лишнюю жидкость.

Позвольте мозгу прилипнуть к слайду.

Используя небольшие кусочки покровного стекла в качестве распорок, положите на них покровный лист. Добавьте реагент против выцветания и запечатайте его.

Под конфокальным микроскопом можно получать изображения с использованием различных длин волн возбуждения для красной и желтой флуоресценции.

Используя программное обеспечение для анализа изображений, количественно определите агрегаты белков.

Колокализация красной и желтой флуоресценции указывает на распространение мутантных белков.

После того, как все мозги будут препарированы, перенесите трубку для сбора в нататор при комнатной температуре и покачивайте их около 5 минут. После периода фиксации удалите большую часть фиксирующего раствора с помощью пипетки P1000 и выбросьте его, стараясь очень осторожно оставить мозг в пробирках. Для этого требуется мягкое отсасывание и тщательное наблюдение.

Далее добавьте к мозгам 1 миллилитр свежего ПБСТ. Закройте трубку крышкой и дайте ей покачаться на гайтаторе около минуты, чтобы смыть остатки фиксатора. Затем удалите раствор и повторите этот короткий шаг промывки.

После двух коротких стирок следует одно 5-минутное мытье, затем три 20-минутных мытья и, наконец, одно 1-часовое мытье. После последнего промывки осторожно удалите большую часть PBST и погрузите мозги в 30 микролитров реагента против выцветания на основе глицерина. Затем инкубируйте мозг при температуре 4 градуса Цельсия в темноте без движения в течение от 1 до 24 часов.

Позже извлеките мозги из пробирки для сбора с помощью затупленного наконечника пипетки и перенесите их на предметное стекло микроскопа. Затем аккуратно ориентируйте мозг по мере необходимости для визуализации с помощью щипцов. Несколько образцов могут быть установлены на одном и том же предметном стекле в отдельные ряды.

Затем удалите излишки реагента против выцветания со предметного стекла с помощью уголка сложенной лабораторной салфетки. Не допускайте контакта тканей с мозгом. Затем оставьте образцы в темноте на 5-10 минут, чтобы мозг прилип к предметному стеклу.

Затем возьмите небольшие кусочки битого покровного стекла и расположите их вокруг мозга, покрывая площадь около 19 квадратных миллиметров. Затем аккуратно опустите покровное стекло площадью 22 квадратного миллиметра над мозаикой из мозгов и стекла, чтобы сделать крепление для моста. Затем медленно нанесите свежий реагент против выцветания под защитный листок, чтобы он заполнил пустые места. Делайте это очень аккуратно, чтобы мозги и стекло оставались на месте. Затем заклейте покровное стекло лаком для ногтей. Во-первых, просто нанесите его на углы. Дайте угловым проколам высохнуть за 5-10 минут до завершения запечатывания по краям. Мозг должен быть визуализирован как можно скорее.

Визуализируйте смонтированный мозг с помощью конфокального микроскопа, оснащенного 40-кратным или 63-кратным масляным объективом, чтобы собрать z-срезы в области мозга, где экспрессируются трансгены. Затем проанализируйте данные, количественно оценив точки в отдельных z-срезах или, в качестве альтернативы, после рендеринга срезов в трех измерениях.

Чтобы количественно оценить мутантные агрегаты Хантингтона, которые хорошо разделены и имеют слабый фоновый сигнал, откройте конфокальную z-серию в режиме 3D-просмотра. Затем с помощью Мастера анализа определите отдельные пятна в выбранном канале.

В настройках настройте пороговые значения и фильтры, чтобы точно представить все агрегаты разнородного размера как отдельные объекты на изображении. Затем включите параметр «Разделить объекты» в разделе «Предварительный фильтр двоичной обработки», чтобы разделить тесно связанные агрегаты. Количественная информация об объектах, идентифицированных программным обеспечением, отображается в разделе «Измерения».

После подсчета точек дополнительно охарактеризуйте их в программном обеспечении для анализа изображений. Например, выполните соответствующие измерения пятен или поверхностей, чтобы получить информацию о совокупном диаметре, объеме или интенсивности. Некоторые агрегаты Гентингтона дикого типа можно количественно оценить, вручную перемещаясь по z-стеку и подсчитывая зеленые точки, которые можно отличить от окружающего диффузного сигнала.

Будьте осторожны, чтобы не подсчитывать отдельные агрегаты дважды, если они появляются более чем в одном срезе. Еще одним интересным анализом является определение частоты колокализации между агрегатами Huntington Q25-YFP и Huntington Q91-mCherry. Делайте это с помощью ручного подсчета, перемещая срез за срезом через конфокальный z-стек.