Живая изображений Ячейка Сенная Bacillus И Пневмококк С использованием средства аварийного Покадровый микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы получить изображение живых клеток в процессе роста и деления с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы можно было изучить влияние клеточной истории и происхождения на клеточное развитие бактерий. Это достигается путем предварительного перевода клеток из жидкой среды с относительно высокой концентрацией питательных веществ в жидкую среду для голодания. Далее микроскопическое предметное стекло, на котором бактериальные клетки вырастут в микроколонию.

Подготавливается однослойный. Затем записывается фильм с флуоресцентной микроскопией. Наконец, фильм обрабатывается и данные анализируются.

В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают развитие одной бактериальной клетки с помощью покадровой флуоресцентной микроскопии. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как проточная цитометрия и стандартная микроскопия, заключается в том, что он позволяет отслеживать динамику белка, клеточное поведение и развитие отдельных клеток во времени, демонстрируя процедуру в конусе, аспирант из своей лаборатории Чтобы получить b tuus инокуляционные клетки от минус 80 градусов по Цельсию, запасы в 10 миллилитров покадровой микроскопии или среды TLM в стерильных колбах с добавлением антибиотиков, если это необходимо, выращивание клеток в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия и 225 об/мин в стерильной колбе на следующее утро, чтобы разграбить ячейки один к 10 в предварительно теплой, химически определенной среде или CDM без антибиотиков, вырастить тончайшие клетки пчелы до средней экспоненциальной фазы, что занимает примерно четыре часа. Измерьте поглощение культуры на уровне 600 нанометров и разбавьте клетки примерно до 600 или 0,035.

Использование CDM. Этот внешний диаметр гарантирует, что отдельные клетки с соответствующим расстоянием между клетками будут обнаружены на предметном стекле микроскопа для покадровой микроскопии. За час до того, как клетки достигнут среднего экспоненциального роста.

Приготовьте предметное стекло микроскопа, очистив два предметных стекла 70% этанолом и водой. Снимите одну из пластиковых крышек с генной рамки, стараясь не вызвать разборку пластиковой крышки с другой стороны рамки. Прикрепите генную рамку в середину одного из стеклянных стекол, сначала приклеив его к одной стороне, а затем направляя остальные ногтем

Используйте микроволновую печь, чтобы растворить 150 миллиграммов высокого разрешения с низким уровнем таяния. В 10 миллилитрах CDM убедитесь, что арос полностью растворен, чтобы предотвратить фоновую флуоресценцию. Пипеткой введите 500 микролитров теплого агро CDM в середину генной рамки, убедившись, что вся территория, включая границы, полностью покрыта.

Быстрая работа для предотвращения чрезмерного высыхания арос. Поместите второе предметное стекло на заполненную Aros CDM генную рамку, стараясь избежать образования пузырьков воздуха. Поместите бутерброд в горизонтальное положение при температуре четыре градуса Цельсия на 45 минут, чтобы агрос достаточно застыл.

Как только арос осторожно застынет, снимите верхнее стекло. С помощью лезвия бритвы вырежьте агрополоски шириной около пяти миллиметров, на которых будут расти бактерии. На одном слайде можно использовать максимум три полосы, разделенные примерно четырьмя миллиметрическими промежутками с каждой стороны.

Эти пространства будут обеспечивать воздух, который необходим для роста Blu. Осторожно снимите вторую и последнюю пластиковую крышку с генной рамки, чтобы обнажить липкую сторону. Загрузите отдельные элементы примерно в 2,5 микролитра жидкости на твердую среду, начиная с верхней части агросной площадки, не касаясь ее.

С помощью наконечника пипетки обеспечьте равномерное распределение среды, наклоняя предметное стекло вверх и вниз. Наденьте чистую крышку микроскопа на генную рамку, чтобы полностью прикрепить защитное стекло. С помощью ногтя надавите так после того, как ячейки будут загружены.

Очень важно подождать, пока жидкость высохнет достаточно долго, чтобы у вас не появились плавательные клетки и разрастание в несколько слоев. Однако, если клетки сушить слишком долго, то у них возникнут проблемы с выращиванием в микрохолонный монослой. Таким образом, время, необходимое для сушки предметных стекол, зависит от эксперимента и не может быть измерено.

Чтобы предотвратить проблемы с автофокусировкой в течение первых часов эксперимента с интервальной съемкой, предварительно прогрейте предметное стекло в течение часа при температуре 30 градусов по Цельсию, чтобы подготовиться к интервальной микроскопии. Прогрейте климатическую камеру не менее двух часов. Перед началом эксперимента выберите подходящие фильтры объектива и дихроичное зеркало в соответствии с вашей экспериментальной установкой.

Для длительных экспериментов убедитесь, что между источником света и образцом размещен УФ-фильтр. Кроме того, если это возможно, блокируйте часть возбуждающего света с помощью фильтров нейтральной плотности, чтобы свести к минимуму воздействие. Запрограммируйте эксперимент в соответствии с конкретной экспериментальной установкой.

До начала эксперимента целесообразно определить количество света, необходимое для конкретных конструкций, а также настройки автофокусировки для других покадровых микроскопов или бактерий. Более короткое время экспозиции и более низкие уровни возбуждающего света сведут к минимуму обесцвечивание и фототоксичность Используйте скопический свет для функции автофокусировки. Наконец, поместите подготовленное предметное стекло в камеру предварительного нагрева микроскопа и наблюдайте за разрастанием отдельных клеток в монослой микроколонии при температуре 30 градусов Цельсия.

Успешный эксперимент с покадровой флуоресценцией позволит получить монослой микроколонии, полностью расположенный в поле зрения. В конце эксперимента в этом фильме светлое поле находится слева, и можно увидеть флуоресценцию. Справа.

Вот пример микроколонии B Subtles, в которой некоторые клетки росли друг на друге, что затрудняет точное отслеживание их истории, а также правильное измерение уровня флуоресценции. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как успешно подготовить микроскопический образец для цейтраферной микроскопии и как выполнить цейтраферную флуоресцентную микроскопию. Экспериментируйте с клетками BACE.