Живая изображений Ячейка Сенная Bacillus И Пневмококк С использованием средства аварийного Покадровый микроскопии
28 июля 2011 г.
Этот протокол обеспечивает шаг за шагом процедуру наблюдения одного поведение клеток различных бактерий во времени с использованием автоматизированных флуоресценции покадровой микроскопии. Кроме того, мы предоставляем руководящие принципы, как анализировать микроскопии изображений.
Общая цель данной процедуры заключается в получении изображений живых клеток в процессе их роста и деления с помощью флуоресцентной микроскопии для изучения влияния истории и происхождения клеток на клеточное развитие бактерий. Это достигается путем первоначального переноса клеток из жидкой среды с относительно высокой концентрацией питательных веществ в жидкую среду голодания. Затем используется предметное стекло, на котором бактериальные клетки будут расти, образуя микроколонию.
Подготавливается монослой. Затем записывается видео с помощью флуоресцентной микроскопии в режиме тайм-лапс. В завершение видео обрабатывается, и полученные данные анализируются.
В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие развитие отдельной бактериальной клетки с помощью флуоресцентной микроскопии с записью временных интервалов (time-lapse). Основное преимущество этого метода перед существующими такими, как проточная цитометрия и стандартная микроскопия, заключается в том, что он позволяет в реальном времени отслеживать динамику белков, поведение клеток и развитие одиночных клеток; процедуру продемонстрирует Коун, аспирант моей лаборатории. Для подготовки B. subtilis инокулируют клетки из стоков, хранившихся при -80 °C, в 10 мл среды для микроскопии с записью временных интервалов (TLM medium) в стерильные колбы с шейкой, дополненные антибиотиками при необходимости. Клетки выращивают в течение ночи при 30 °C и 225 RPM в стерильной колбе с шейкой. На следующее утро клетки переносятся в соотношении от 1:10 в предварительно прогретую химически определенную среду (CDM) без антибиотиков. Клетки B. subtilis культивируют до средней экспоненциальной фазы, что занимает примерно четыре часа. Измеряют оптическую плотность культуры при 600 nm и разбавляют клетки до приблизительного значения A600 равного 0,035.
Используйте CDM. Данное значение OD гарантирует, что отдельные клетки с подходящим расстоянием между ними будут нанесены на предметное стекло микроскопа для таймлапс-микроскопии. За один час до того, как клетки достигнут середины экспоненциальной фазы роста.
Подготовьте предметное стекло, очистив два стеклянных слайда 70% ethanol и водой. Снимите одну из пластиковых крышек с рамки для геля, стараясь не привести к отсоединению пластиковой крышки с другой стороны рамки. Закрепите рамку для геля посередине одного из стеклянных слайдов, сначала прижав ее с одной стороны, а затем аккуратно прижимая остальную часть ногтем.
Используйте микроволновую печь для растворения 150 мг высокоразрешающего низкоплавящего агарозы. В 10 мл CDM убедитесь, что агароза полностью растворилась, чтобы предотвратить фоновую флуоресценцию. Пипеткой внесите 500 µL теплой смеси агарозы и CDM в центр рамки для геля, убедившись, что вся область, включая края, полностью покрыта.
Работайте быстро, чтобы предотвратить чрезмерное высыхание agarose. Поместите второе предметное стекло на рамку с наполнителем Aros CDM, стараясь избегать образования пузырьков воздуха. Положите полученный «сэндвич» в горизонтальном положении при температуре 4 °C на 45 минут, чтобы agarose достаточно затвердел.
После того как агар затвердеет, осторожно снимите верхнее стекло. С помощью лезвия бритвы вырежьте полоски агара шириной около five millimeters, на которых будут расти бактерии. На одном предметном стекле можно использовать не более трех полосок, разделенных интервалами примерно four millimeter с каждой стороны.
Эти пространства обеспечат доступ воздуха, необходимого для роста Blu. Осторожно снимите вторую и последнюю пластиковую крышку с генной рамки, чтобы открыть липкую сторону. Нанесите отдельные клетки в объеме примерно 2.5 µL жидкости на твердую среду, начиная с верхней части агарозной подушечки, не касаясь ее.
С помощью наконечника пипетки равномерно распределите среду, наклоняя предметное стекло вверх и вниз. Поместите чистое микроскопическое покровное стекло на рамку препарата, чтобы полностью закрепить его. Надавите ногтем после того, как клетки будут загружены.
Крайне важно подождать достаточного высыхания жидкости, чтобы избежать «плавания» клеток и их роста в несколько слоев. Однако при слишком длительном высушивании клеток могут возникнуть проблемы с формированием монослоя микрохолонов. Таким образом, время высушивания предметных стекол зависит от конкретного эксперимента и не имеет фиксированного значения.
Следовательно, конечно, необходимо набраться опыта в этом деле. Чтобы избежать проблем с автофокусом в первые часы эксперимента с таймлапс-съемкой, предварительно прогрейте предметное стекло в течение одного часа при 30 °C. Предварительно прогрейте климатическую камеру не менее двух часов. Перед началом эксперимента выберите соответствующие объектив, фильтры и дихроичное зеркало в соответствии с вашей экспериментальной установкой.
Для длительных экспериментов убедитесь, что между источником света и образцом установлен УФ-фильтр. Кроме того, по возможности, ограничьте часть возбуждающего света с помощью нейтральных светофильтров, чтобы минимизировать экспозицию. Запрограммируйте эксперимент в соответствии с конкретной установкой.
Перед началом основного эксперимента рекомендуется определить количество света, необходимое для конкретных конструкций, а также настройки автоматической фокусировки для других микроскопов для таймлапс-съемки или других бактерий. Более короткое время экспозиции и низкие уровни возбуждающего света позволят минимизировать выгорание и фототоксичность. Для функции автоматической фокусировки используйте микроскопический свет. Наконец, поместите подготовленный предметное стекло в предварительно нагретую климатическую камеру микроскопа и наблюдайте за разрастанием одиночных клеток в монослой микроколоний при 30 °C.
Успешный эксперимент по флуоресцентной таймлапс-съемке позволит получить монослой микроколоний, полностью расположенный в поле зрения. В конце эксперимента в данном видео слева представлено изображение в светлом поле, а справа — флуоресценция.
Перед вами пример микроколонии B Subtles, в которой некоторые клетки росли друг на друге, что затрудняет точное отслеживание их истории, а также правильное измерение уровней их флуоресценции. После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как успешно подготовить микроскопический образец для таймлапс-микроскопии и как провести таймлапс-флуоресцентную микроскопию. Проведите эксперимент с клетками BACE.
Обзор
В данном протоколе описан метод мониторинга поведения отдельных бактериальных клеток во времени с помощью автоматизированной флуоресцентной таймлапс-микроскопии. Он включает подробные инструкции по подготовке образцов и анализу полученных изображений.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Клеточная биология
- Флуоресцентная микроскопия
Теоретическая часть
- Понимание поведения бактериальных клеток имеет решающее значение для различных биологических исследований.
- Микроскопия с регистрацией временных интервалов (time-lapse microscopy) позволяет наблюдать за динамикой живых клеток.
- Данный метод дает представление о влиянии предшествующей истории клетки на ее развитие.
- Традиционные методы могут не фиксировать нюансы поведения отдельных клеток.
Цель исследования
- Для визуализации живых бактериальных клеток в процессе роста и деления.
- Для анализа влияния условий содержания питательных веществ на развитие клеток.
- Для более глубокого понимания динамики белков и поведения клеток.
Используемые методы
- Перенесите клетки в голодательную среду для инициации роста.
- Подготовьте предметное стекло микроскопа для выращивания бактерий.
- Запишите видео с помощью флуоресцентной микроскопии в режиме тайм-лапс.
- Проанализируйте записанные данные для наблюдения за развитием клеток.
Основные результаты
- Успешная визуализация отдельных бактериальных клеток в динамике.
- Наблюдение за формированием и развитием микроколоний.
- Изучение динамики экспрессии белков в отдельных клетках.
- Демонстрация преимуществ таймлапс-микроскопии по сравнению с традиционными методами.
Выводы
- Данный протокол позволяет эффективно изучать поведение отдельных бактериальных клеток.
- Интервальная микроскопия (тайм-лапс микроскопия) является мощным инструментом для клеточного анализа.
- В будущих исследованиях данный метод может быть использован для изучения других аспектов динамики бактерий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Мониторинг поведения отдельных бактериальных клеток позволяет снизить механистические риски при валидации мишеней антимикробных препаратов, выявляя гетерогенность роста, деления и экспрессии белков. Такой подход повышает прогностическую уверенность на ранних этапах поиска за счет установления связи между клеточной историей и фенотипическими результатами, что помогает при расстановке приоритетов в портфеле разработок антибиотиков. Таймлапс-микроскопия обеспечивает трансляционную преемственность от механистического скрининга до оценки на доклинических моделях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем отслеживания ответов отдельных клеток на изменение содержания питательных веществ и генетические пертурбации с течением времени.
- Операционная ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством прямого наблюдения за динамикой белков и поведением отдельных клеток.
- Прогностическая ценность: Способствует идентификации перспективных соединений-лидеров путем корреляции клеточного происхождения с фенотипической стабильностью на протяжении нескольких поколений.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: подготавливает валидированные биологические системы для последующего скрининга соединений путем обеспечения воспроизводимого формирования микроколоний на агарозных подушечках.
- Количественные показатели: генерирует данные флуоресценции и светлого поля с временным разрешением, что позволяет измерять скорость роста, время деления и локализацию белков.
- Масштабируемость: поддерживает повторное использование платформы для различных видов бактерий (B. subtilis, S. pneumoniae) для стандартизированной оценки мишеней антимикробных препаратов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: моделирование поведения патогенов на клинически значимых видах, таких как S. pneumoniae, для получения данных при изучении механизмов действия противомикробных препаратов.
- Соответствие трансляционным биомаркерам: установление связи между динамикой белков на уровне отдельных клеток и фенотипами на уровне популяции, что обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки на основе биомаркеров.
- Снижение рисков при разработке: уменьшение неопределенности в понимании механизмов в доклинических моделях путем подтверждения воздействия на мишени с разрешением до одной клетки.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод позволяет использовать таймлапс-визуализацию отдельных клеток на этапе между валидацией мишени и оптимизацией соединений-лидеров, что дает возможность проверить гипотезы и снизить механистические риски до начала скрининга соединений.
- Открытия в биологии: способствует уточнению путей за счет визуализации того, как динамика экспрессии генов влияет на поведение клеток во время роста и деления.
- Скрининг: обеспечивает получение готовых к анализу микроколоний со стандартизированным расстоянием между ними и формированием монослоя для надежной оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет количественные зависимые переменные, включая интенсивность флуоресценции, время деления и отслеживание линий для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: связывают наблюдения на уровне отдельных клеток с доклинической преемственностью посредством моделирования поведения, зависящего от происхождения, в системах патогенов.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность повторного использования микроскопии для межпроектной оценки антимикробных мишеней на моделях грамположительных бактерий.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Повышение точности прогнозирования при валидации мишеней за счет прямого наблюдения за динамикой белков в отдельных клетках и поведенной гетерогенностью.
- Операционная ценность: Стандартизированная подготовка предметных стекол и контроль условий окружающей среды обеспечивают воспроизводимость результатов в разных лабораториях и сериях экспериментов.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет снижения рисков, связанных с мишенями, на основе согласованности ответов отдельных клеток, а не средних показателей популяции.
- Влияние на портфель: Приоритизация антимикробных кандидатов с учетом рисков с использованием фенотипических данных с разрешением по линиям для исключения ложноположительных результатов, вызванных популяционным маскированием.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области методов культивирования микроорганизмов, флуоресцентной микроскопии и использования программного обеспечения для анализа изображений, такого как ImageJ.
- Необходимы термостатируемые камеры, нейтральные светофильтры и защита от УФ-излучения для проведения длительной визуализации.
- Требуется межкомандная стандартизация процессов подготовки предметных стекол, концентрации агарозы и протоколов внесения клеток для обеспечения согласованности результатов между лабораториями.
- При адаптации метода следует оптимизировать толщину слоя агарозы и состав питательной среды для различных видов бактерий и скоростей их роста.
- Практические ограничения включают риск фототоксичности при длительной визуализации и сложности отслеживания клеток, растущих в виде многослойных образований.
