Анализ одной ячейки Microfluidic Сенная палочка

Общая цель этой микрофлюидной экспериментальной установки заключается в том, чтобы обеспечить долгосрочное наблюдение за отдельными бактериальными клетками в постоянных, строго контролируемых условиях окружающей среды. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области физиологии бактерий, например, каковы долгосрочные паттерны реакции отдельных клеток на стресс или как гетерогенный фенотип в популяции изменяется со временем. Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы можем наблюдать отдельные клеточные линии в течение десятков или даже сотен поколений в постоянных, однородных и строго контролируемых условиях окружающей среды.

После приготовления полимера PDMS по текстовому протоколу поместите силиконовый мастер на кусок цельной алюминиевой фольги в чашке Петри из полистирола. Вылейте дегазированную смесь PDMS на мастер на глубину примерно до пяти миллиметров. Затем дегазируйте блюдо не менее 10 минут.

Высушите PDMS в духовке при температуре 60 градусов Цельсия в течение не менее одного часа и охладите до комнатной температуры. Затем снимите с пластины алюминиевую фольгу, содержащую мастер и отвержденный PDMS. Аккуратно надрежьте его и снимите алюминиевую фольгу со спины мастера.

Затем аккуратно отслаиваем ПДМС от мастера. В качестве пластины обычно включают несколько микрофлюидных устройств с немного отличающимися размерами. С помощью чистого острого скальпеля разрежьте одно устройство до нужного размера.

Поместите кусок полупрозрачной офисной ленты на сторону устройства с рисунком, чтобы улучшить видимость элементов с рисунком. Входные и выпускные отверстия обозначены как круглые области на противоположных концах видимых жидкостных каналов. Переверните устройство PDMS моделью вниз и с помощью биопсийного перфоратора диаметром 0,75 мм проведите устройство до отмеченных точек.

Затем выбросьте перфорацию. Для удаления перфорации с устройства может потребоваться пинцет. Вставьте очищенное и высушенное покровное стекло и устройство PDMS в кислородно-плазменный очиститель и обработайте устройство плазмой с настройками, показанными здесь.

Сразу после окончания плазменной обработки снимите устройство и крышку стекла с плазменного очистителя. Переверните PDMS и поместите его в центр покровного стекла так, чтобы сторона шаблона соприкасалась со стеклом. Убедитесь, что каналы подачи выровнены с длинным доступом покровного стекла.

Очень осторожно надавите, чтобы убедиться, что PDMS плотно прилегает к стеклу. Запекайте собранное устройство в духовке при температуре 60 градусов Цельсия не менее одного часа. После запекания вручную убедитесь, что PDMS приклеен к стеклу, осторожно надавливая на один угол устройства.

После резки полимерных трубок в соответствии с текстовым протоколом соберите Y-образные соединения для пережимных клапанов, если они используются, вырезав и присоединив двухсантиметровые отрезки гибких силиконовых трубок к верхним заусеницам Y-образной трубки и односантиметровые отрезки силиконовой трубки к нижней заусенице Y. Далее отрежьте 10-сантиметровые отрезки полимерных трубок, затем соедините их одним концом с переключающим соединением, вставив их в односантиметровые сегменты силиконовой трубки на Нижнюю заусеницу Y. Соедините отрезки трубок на другом конце с иглами 21-го калибра, которые были извлечены из их пластиковых адаптеров шприца и согнуты примерно на 90 градусов примерно в девяти миллиметрах от конца иглы. Подсоедините тупые иглы 21-го калибра к одному концу сегментов трубки, которые будут идти от шприцев к переключающему устройству, вставив иглы в трубку. Вставьте другие концы трубки каждого отрезка в сегменты силиконовых трубок на входных заусеницах Y-образных соединений.

После наполнения шприцев бактериальной питательной средой, дополненной БСА, согласно текстовому протоколу, подсоедините загруженные шприцы к подготовленным иглам 21 калибра, присоедините к входной трубке и загрузите шприцы в шприцевые насосы. Продувайте воздух из входного водопровода, запуская шприцевые насосы с высокой скоростью потока и ориентируя шприцевые насосы вертикально, постукивая по шприцам, чтобы пузырьки воздуха поднимались наверх. После того, как воздух будет удален из шприца, расположите шприцевой насос горизонтально и постепенно постукивайте или перенаправляйте полимерные линии от шприцев вверх через переключательное устройство, чтобы выбить и продуть любые пузырьки воздуха.

Повторите этот процесс для второй банки шприцев при смене среды. После того, как пузырьки воздуха будут удалены, установите второй фазовый шприцевой насос на 1,5 микролитра в минуту, затем приостановите подачу. Поместите небольшие связующие зажимы на сегменты гибких трубок на ответвлении Y-образных соединений, соответствующих второй фазе среды, и продолжайте работу насоса первой фазы для продувки второй среды после Y-образного соединения.

Чтобы загрузить устройство PDMS, начните с аккуратного помещения пустых тонких наконечников микропипеток с загрузкой гелем в выпускные отверстия микрофлюидного устройства. С помощью тонких гелеобразных наконечников с микропипеткой P200 пассивируйте устройство, вводя среду, содержащую один миллиграмм на миллилитр BSA, во входные отверстия, наблюдая за наконечниками и выходными отверстиями, чтобы контролировать заполнение микрофлюидных каналов. Инкубируйте устройство при комнатной температуре в течение примерно пяти минут.

Далее, используя аналогичные наконечники, нагрузите каждый канал повторно подвешенными элементами, используя наконечники в выходном канале, чтобы следить за прохождением ячеек через устройство. Аккуратно извлеките гелеобразующие наконечники из выпускных отверстий, работая по одному, чтобы не повредить устройство. Центрифугируйте устройство в настольной микроцентрифуге в соответствующем адаптере ротора при примерно 6000 g в течение 10 минут.

Проверьте успешную загрузку под микроскопом, но без прикрепления прибора к вкладышу предметного стекла. Аккуратно закрепите загруженное устройство на сценической вставке, прикрепив защитное стекло с обеих сторон PDMS к нижней части сценической вставки. Переверните вставное устройство в сборе так, чтобы PDMS был обращен вверх, и положите его на мягкую поверхность, например, на пылезащитную салфетку.

Отрегулируйте расход шприцевого насоса первой фазы до 35 микролитров в минуту. Затем, работая с одной полосой за раз, вставьте входную иглу, а затем выходную иглу, которая идет к стакану для отходов. После визуального осмотра устройства на предмет утечек осмотрите выпускную трубку на предмет появления лишних ячеек, которые проявляются в виде мутной полосы в среднем мениске, которая будет медленно продвигаться в сторону стакана для отходов.

После того, как устройство проработает примерно 15 минут, установите первую фазу шприцевого насоса на 1,5 микролитра в минуту и приостановите поток. Поднесите весь насос и аппарат к инвертированному флуоресцентному микроскопу и снова запустите поток среды первой фазы со скоростью 1,5 микролитра в минуту. Осторожно закрепите вставку-столик вместе с устройством на микроскопе, при необходимости используя ленту для прокладки входной и выходной трубок.

Найдите соответствующие позиции на устройстве для визуализации и начните визуализацию по мере необходимости. Обратите внимание, что клеткам обычно требуется несколько часов для считывания данных в установившемся состоянии, экспоненциальном фазовом росте, и начало получения изображения может быть отложено по мере необходимости, чтобы визуализация начиналась после периода равновесия. Чтобы переключить среду между последовательными раундами визуализации, приостановите поток шприцевого насоса первой фазы, осторожно отсоедините связующие зажимы от силиконовой трубки второй фазы, переместив каждый из них к силиконовой трубке на первой фазе Y-образного соединения, затем снимите паузу с потока шприцевого насоса второй фазы и продолжайте визуализацию.

Как было оценено с помощью фазово-контрастной микроскопии, перед присоединением микрофлюидного трубопровода к устройству, начальная загрузка клеток будет считаться успешной, если все или почти все микрофлюидные боковые каналы содержат одну или несколько бактериальных клеток. После первоначальной загрузки устройство уравновешивается при относительно высокой скорости потока. Как показано на рисунке, микроскопическое исследование уравновешенного устройства должно выявить несколько ячеек, объединенных в одну цепочку в большинстве боковых каналов.

Как только уравновешенное устройство помещается в микроскоп под действием потока со скоростью 1,5 микролитра в минуту при 37 градусах Цельсия, клетки возобновят равномерный и постоянный экспоненциальный фазовый рост в течение примерно двух часов. Клетки, возобновившие экспоненциальный фазовый рост, могут быть надежно визуализированы с помощью светлопольной или флуоресцентной микроскопии в течение не менее 24 часов. Введение переключателя среды расширяет диапазон экспериментов, которые могут быть проведены, но также увеличивает частоту катастрофической гибели клеток из-за наличия пузырьков воздуха или кластеров клеток на входе, которые смещаются и проходят через питательный канал.

После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за пять часов, если она выполнена правильно. С помощью этой процедуры, с различными флуоресцентными репортерами, штаммами и условиями окружающей среды, можно исследовать широкий спектр физиологических явлений, включая очень редкие или преходящие события.