Визуализация активности протеинкиназы А у мышей с помощью двухфотонной флуоресцентной микроскопии с визуализацией времени жизни

Закрепите мышь под наркозом с краниальным окном над моторной корой головного мозга на беговой дорожке.

Мышь экспрессирует репортер Protein Kinase-A в нейронах коры головного мозга.

Расположите беговую дорожку под двухфотонным объективом FLIM.

Добавьте каплю воды между объективом и черепным окном.

Дайте мыши проснуться и акклиматизироваться к беговой дорожке.

Используя светлопольное освещение, определите местоположение области изображения. Закройте корпус микроскопа, чтобы заблокировать внешний свет.

Установите параметры визуализации, начните вращение беговой дорожки, чтобы вызвать локомоцию, и начните визуализацию.

Принудительная локомоция активирует PKA, которая фосфорилирует репортер, приближая его донора и акцепторные флуорофоры.

Микроскоп направляет инфракрасный лазер, возбуждая донора к передаче энергии акцептору, сокращая время жизни флуоресценции донора.

Когда локомоция прекращается, PKA и репортер возвращаются в свои неактивные состояния, уменьшая передачу энергии и увеличивая время жизни флуоресценции донора.

Проанализируйте изображения, чтобы сравнить уровни корковой ФКА во время отдыха и передвижения.

По крайней мере, через две недели после установки черепного окна установите длину волны двухфотонного лазера возбуждения на 960 нанометров и подтвердите отсутствие реакции на защемление пальца ноги у экспериментальной мыши, находящейся под наркозом. Поместите мышь под наркозом на беговую дорожку с электроприводом и прикрепите головную пластину мыши к держателю головной пластины конфигурации беговой дорожки. Очистите поверхность краниального оконного покровного стекла 70% этанолом и поместите моторизованную беговую дорожку под объектив 2pFLIM.

Нанесите каплю дистиллированной воды между покровным стеклом черепа в объективе и дайте мышке проснуться и акклиматизироваться к беговой дорожке и микроскопу в течение как минимум 10 минут. Перейдите к месту инъекции под эпиосвещением и задокументируйте реперные элементы под светлым полем, чтобы помочь в визуализации той же области интереса во время последующих сеансов визуализации.

Выключите источник света эпиподсветки. Закройте корпус микроскопа 2pFLIM. Для активации фотоумножителя микроскопа 2pFLIM необходимо включить аппаратную команду управления напряжением. Чтобы получить изображение Z-стека 2pFLIM, установите размер изображения 128 на 128 пикселей. Скорость сканирования до 2 миллисекунд на линию, поле зрения до 90 до 100 микрометров в кадре, в среднем до трех кадров.

Отрегулируйте параметры изображения в зависимости от подготовки и конфигурации оборудования. И осмотрите полученное изображение в FLIM виде. Используйте уменьшенное поле зрения, уменьшенную скорость сканирования, увеличенную мощность лазера и увеличенное количество усредненных кадров для увеличения интегрального количества фотонов и уменьшения ошибки оценки срока службы по мере необходимости.

Убедитесь, что вы получили достаточное количество фотонов для каждой области интереса. Реальное количество интегрированных фотографий для положительной сомы составляет от 1000 до 10000 фотонов.

Когда изображение будет оптимизировано, получите базовые повторяющиеся изображения Z-стека через равные промежутки времени в течение не менее 15 минут при 0 скорости на беговой дорожке. Затем установите вращение беговой дорожки примерно на сантиметры в секунду в течение 15 минут во время получения изображений 2pFLIM, а затем в течение не менее 20 минут после выключения вращения беговой дорожки, чтобы оценить продолжительность активности протеинкиназы А после прекращения принудительной локомоции.

Для анализа изображений 2pFLIM откройте изображения в режиме просмотра пленки и нажмите на поля минимального и максимального диапазона подсчета одиночных фотонов, чтобы ввести соответствующие значения минимального и максимального диапазона подсчета одиночных фотонов. Щелкните значение time 0, чтобы ввести значение time 0, и щелкните поле lifetime luminance minimum threshold value, чтобы ввести желаемое пороговое значение в диапазоне от 5 до 30 фотонов.

Нажмите кнопку Создать группу и назначьте имя экспериментальной группы, чтобы создать группу, объединяющую данные из каждого добавленного образа FLIM. Щелкните Область интереса в модуле управления областью интереса и нарисуйте область интереса вокруг альфа-положительной сомы T-ACCR. Переместите нижний и верхний предел Z в ползунках управления Z-стеком, чтобы уменьшить диапазон Z-стека и свести к минимуму загрязнение сигнала, исходящего от фоновых фотонов и других Z-провалов, а затем нажмите плюс, чтобы добавить изображение FLIM в группу.

Нажмите calc, чтобы вычислить среднее время жизни в погрешности оценки времени жизни для интересующей области, и откройте следующий файл в серии изображений 2pFLIM. Измеряйте одну и ту же альфа-положительную сому T-ACCR на каждом последующем изображении с течением времени, при необходимости корректируя область интереса вокруг сомы. Когда все изображения будут проанализированы, выберите дельта-среднее время испускания фотонов дельта-среднее фотоизлучение T0 в модуле группового контроля и щелкните поле базового номера, чтобы ввести индекс интересующих изображений, чтобы определить изображения, используемые для расчета базового времени жизни.

Затем нажмите на график, чтобы построить график, содержащий реакцию FLIM на альфа-положительную активность T-ACCR альфа во время эксперимента в определенных областях интереса, чтобы можно было сравнить активность протеинкиназы А во время локомоции киназы в различных областях интереса.