Флуоресцентная визуализация агрегации белка PolyQ в нейронах Caenorhabditis elegans

Начните с обезболенных червей контрольной группы и червей с дефицитом шаперона Caenorhabditis elegans.

Обе группы экспрессируют помеченные флуорофорами белки polyQ в своих нейронах, которые склонны к неправильному сворачиванию.

У контрольных червей белки-шапероны ограничивают неправильно свернутую агрегацию polyQ, в то время как у червей с дефицитом шаперона неправильно свернутый polyQ легко образует агрегаты.

Поместите предметное стекло на предметный столик конфокального микроскопа для флуоресцентной визуализационной микроскопии (FLIM).

Подсветите червей с помощью импульсного лазера.

Лазер возбуждает флуорофор, который испускает фотон при возвращении в основное состояние.

FLIM измеряет время жизни флуоресценции — время, в течение которого флуорофор остается в возбужденном состоянии.

У червей с дефицитом шаперонов агрегация polyQ кластеризует флуорофоры, способствуя передаче энергии между соседними флуорофорами, а не излучению фотонов, тем самым сокращая время жизни флуоресценции.

Программное обеспечение FLIM обрабатывает эти времена жизни для создания карт с цветовой кодировкой, что позволяет визуализировать агрегацию.

Уменьшенное время жизни флуоресценции у червей с дефицитом шаперона, по сравнению с контрольной группой, указывает на повышенную агрегацию polyQ.

Убедитесь, что нематоды полностью неподвижны. Откройте программное обеспечение для сбора данных FLIM. Найдите кнопку Tab и нажмите Enable Outputs. Поместите предметное стекло с установленными на нем C. elegans на сцену и, используя объектив с 10-кратным увеличением в режиме пропускания, локализуйте положение нематод на предметном стекле. Снимите предметное стекло, переключите объектив на объектив с 63-кратным увеличением и нанесите необходимую среду для погружения.

Поместите слайд на сцену и локализуйте нематод. Начните сканирование образца. Выберите интересующую область и сфокусируйтесь на ее максимальной плоскости проекции. В интерфейсе программного обеспечения FLIM можно просмотреть количество обнаруженных фотонов. Значение АЦП должно быть в диапазоне от 1 до 10 до четвертого и от 1 до 10 до пятого. При необходимости сместите фокус в другую плоскость или увеличьте мощность лазера, чтобы собрать больше фотонов.

- Убедитесь, что вы избегаете скопления фотонов, но соберете достаточное количество фотонов для создания хорошего соответствия и измерения в течение всей жизни.

- В строке меню выберите вкладку для установки параметров захвата. Выберите «Синхронизация сканирования», чтобы разрешить обнаружение одиночных фотонов. Установите фиксированное время сбора данных или фиксированное количество фотонов. Нажмите кнопку Старт, чтобы начать сбор данных. Откройте программу и импортируйте файлы данных FLIM через «Файл», «Загрузить данные FLIM». Загрузите все образцы из одного состояния, даже если они получены в разных сеансах и из разных биологических повторов.

При необходимости сегментируйте одну нематоду для многих FLIM картинок с помощью Сегментации, Менеджера сегментации. Перетащите инструмент обрезки вокруг области видимости, пока она не будет выделена. По завершении нажмите OK. Выберите небольшую область, в которой появится изображение C. elegans на основе интенсивности. Кривая распада этой области отображается в большом окне распада в правой части интерфейса.

Чтобы экстраполировать время жизни на вкладке Данные, установите произвольное интегрированное минимальное значение в диапазоне от 40 до 300, чтобы исключить пиксели, которые слишком тусклые для хорошей подгонки. Выберите минимальное и максимальное число времени, чтобы ограничить сигнал FLIM этими значениями. Не изменяйте предустановленное количество фотонов от одного. Введите частоту повторения в мегагерцах используемого лазера во время захвата.

Введите максимальное значение затвора, чтобы исключить все насыщенные пиксели. На вкладке Срок службы выберите глобальную фитинг, которая будет использоваться. Не изменяйте никаких других параметров, кроме числа экспоненциальной выборки, если известно, что выбранное затухание флуоресценции является мультиэкспоненциальным и имеет более одного времени жизни.

Загрузите IRF через меню IRF. Чтобы оценить сдвиг IRF, выберите IRF, Оценка, Сдвиг IRF. Набор значений автоматически появляется на вкладке IRF. Как только это будет установлено, не изменяйте никаких других параметров этой вкладки. После того, как все параметры будут установлены, нажмите Fit Data Set. Полученная посадка, выделенная синей линией, должна перекрываться со всеми событиями. Хорошая посадка получается, когда все события выровнены по посадке.

Перейдите на вкладку Параметры, расположенную в верхнем правом меню интерфейса программного обеспечения, и выберите статистику, взвешенное среднее и убедитесь, что значение хи-квадрат максимально близко к единице. Таким образом, значение времени жизни выбранного изображения отображается как тау 1. Экспортируйте любую интересующую вас информацию через Файл, Экспорт изображений интенсивности, Таблицу результатов подгонки, Изображения, Гистограммы.