В естественных условиях Количественная оценка G белком рецептор взаимодействий с использованием спектрально Решено Двухфотонное микроскопии

Общей целью данного эксперимента является определение стоиальной метрической и структурной информации о белке. Все связочные комплексы, экспрессирующие живые биологические клетки, дрожжевые клетки, генетически модифицированы для экспрессии представляющих интерес белков, прикрепленных либо к донору, либо к акцепторному флуоресцентному зонду. Донорные зонды могут возбуждаться непосредственно лазером.

В то время как акцепторы могут возбуждаться только за счет передачи энергии от ближайшего возбужденного донора, клетки подвергаются воздействию света от импульсного лазера ближнего инфракрасного диапазона. Флуоресцентное осеменение зондов разделяется на спектральные составляющие с помощью просвечивающей решетки и проецируется на поверхность ПЗС-матрицы, умножающей электроны. Поэтому получаются полные флуоресцентные спектры от отдельных, всех связок для каждой позиции в образце.

Спектральный профиль обнаруженной флуоресценции зависит от специфического взаимодействия представляющих интерес белков. Данные анализируются для определения для каждого пикселя изображения сканирующей ячейки отдельных излучений от донорного и акцепторного зондов. Эффективность передачи энергии определяется на каждом пикселе изображения, а затем пиксели изгибаются в соответствии с их эффективностью лада и гистограммой.

Интерпретация гистограммы позволяет in vivo определить размер и конфигурацию белка, комплекса. Привет, меня зовут Майкл Стоунман из исследовательской группы Riku в Университете Висконсина в Милуоки. Меня зовут Сингх.

Я из лаборатории Rikus в Висконсине, штат Милуоки. Основное преимущество этой методики заключается в том, что за одно полное сканирование клетки получаются полные профили эмиссии из сотен всех связочных комплексов внутри клетки. Как правило, большинство методов флуоресцентной микроскопии требуют многократного сканирования интересующей клетки для накопления достаточного количества спектральной информации для определения эффективности ладов в различных областях интереса внутри клетки.

Однако диффузионные биохимические реакции могут изменить молекулярный состав этих областей интереса и тем самым ограничить информацию, полученную при сканировании изображения. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении белка, белкового взаимодействия в живых клетках, например, каков вред олигомеров? На какой стадии жизненного цикла белка выращивают олигомеры, и какова роль олигомера этого белка в клеточной функции?

Спектрально разрешенные два фотомикроскопа, аккумулируют спектральную информацию о комплексах олима в ячейке изображения путем сканирования фокуса возбуждающего пучка по интересующему образцу в ряде мест. Пара ортогональных сканирующих зеркал используется для переноса фокуса лазерного луча на образец в двух разных направлениях. Движение сканирующих зеркал контролируется компьютером и синхронизируется с извлечением данных об интенсивности флуоресценции с ПЗС-камеры из линейных сканов, могут быть восстановлены пространственные карты интенсивности флуоресценции, соответствующие определенной длине волны света.

Для того чтобы точно реконструировать пространственные карты интенсивности рентгеновского флуоресцентного излучения и рассчитать фактическую длину волны, соответствующую каждой из этих карт, протокол линейного сканирования должен быть откалиброван с использованием раствора флуоресцеина. Чтобы начать процедуру калибровки, отправьте в спектр возбуждения на длину волны 800 нанометров, что в два раза больше максимальной длины волны возбуждения донорской метки GFP два два, чтобы отправить в спектр возбуждения, транслировать призму, расположенную внутри лазерного резонатора, для изменения дисперсии групповой скорости с помощью компьютерной программы, к которой подключена камера. Отправьте команду на ПЗС-матрицу, чтобы понизить температуру ПЗС-матрицы до минимально достижимой температуры.

Для того, чтобы уменьшить темновой шум. Пипеткой нанесите 10 микролитров раствора флуоресцеина на предметное стекло микроскопа с защитным накладкой так, чтобы тонкий слой образца равномерно диспергировался в области между покровным накладкой и предметным стеклом микроскопа, поместите небольшую каплю иммерсионного масла на поверхность покровного стекла. Теперь закрепите микроскоп, сдвиньте слайд на столик для трансляции XY, Z и переместите слайд и столик в направлении оптической оси Вручную отрегулировав линейный привод, перемещайте предметное стекло до тех пор, пока объектив микроскопа не соприкоснется с каплей иммерсионного масла, переключите камеру в видеорежим сбора данных, чтобы подаваемый свет, попадающий на ПЗС-матрицу, отображался на экране компьютера в режиме реального времени.

Выключите все окружающие лампы в комнате, чтобы уменьшить фоновый шум, обнаруживаемый на ПЗС-матрице. Медленно регулируйте микрометр, контролирующий ступень перемещения в направлении оптической оси, чтобы привести образец в фокальную точку лазерного луча. Когда образец флуоресцеина находится в фокусе, излучение будет отображаться в виде четкой линии на ПЗС-матрице.

Загрузите показания интенсивности пикселей с ПЗС-матрицы на компьютер. Измерьте интенсивность пикселей в зависимости от положения на ПЗС-матрице, открыв загруженную матрицу значений интенсивности на изображении J и проведя линию через флуоресцентную область. Используйте команду дня изображения.

Проанализируйте профиль графика для создания графика, иллюстрирующего спектр излучения образца флуоресцеина. Отрегулируйте инкрементальный параметр зеркала, которое управляет движением лазера. Фокусировка в направлении Y таким образом, чтобы соседние положения по оси y внутри образца приводили к смещению пика флуоресцентных спектров ровно на один пиксель по спектральной размерности на ПЗС-матрице.

Чтобы контролировать это, загрузите интенсивность спектров флуоресцеина для двух разных положений Y в образце. Затем откройте изображения интенсивности с помощью изображения J и найдите положение пикового пикселя для каждого из флуоресцентных спектров. С помощью изображения J курсора, оставив затвор ПЗС-матрицы открытым, отсканируйте лазерный фокус поперек образца в направлении X.

Свет, излучаемый каждым вокселем вдоль линии сканирования, должен падать на ПЗС-матрицу в конце каждого линейного сканирования, хранить данные с ПЗС-матрицы, полученные для этого линейного сканирования, а затем очищать пиксели ПЗС-матрицы. Переместите положение лазера. Фокусируйтесь в направлении Y на величину, определенную ранее.

Затем отсканируйте лазерный луч в направлении X по образцу. Еще раз, оставив открытой шторку ПЗС-матрицы для хранения данных. Повторяйте эту процедуру сканирования линии до тех пор, пока физическая область, примерно на 50% превышающая размеры одной биологической клетки, не будет освещена лазерным светом.

Соотношение между номером строки конкретного изображения линейного сканирования и длиной волны должно быть использовано для реконструкции изображений для получения множественных флуоресцентных карт интенсивности лица бывшей жены на разных длинах волн. Чтобы получить флуоресцентное изображение бывшей жены для определенной длины волны, найдите номер строки на изображении, полученном при первом линейном сканировании, который соответствует этой длине волны. Тогда соседняя строка последующего изображения линейного сканирования соответствует следующей строке изображения флуоресцентного излучения.

Для этой конкретной длины волны сложите все строки изображений, которые соответствуют этой длине волны, чтобы получить пространственные карты интенсивности флуоресценции XY образца на этой длине волны. Повторите эту процедуру для всех других доступных длин волн, чтобы собрать данные о ваших образцах. Сначала извлеките из инкубатора пластины с трансформированными колониями дрожжей.

Должно быть как минимум три типа трансформированных клеток. Клетки, экспрессирующие представляющие интерес белки, помечены обоими типами флуоресцентных зондов. Клетки, экспрессирующие только белки, помеченные донорскими флуоресцентными зондами, и клетки, экспрессирующие только белки, помеченные акцепторными флуоресцентными зондами.

Добавьте 100 микролитров 100 миллимолярных хлоридов калия в микроцентрифужную пробирку. Затем с помощью наконечника микропипетки соскребите от трех до пяти колоний дрожжей с пластины клеток, экспрессирующих белки, помеченные как донором, так и флуоресцентными зондами, а также инокулируйте 100 миллимолярный хлорид калия. С помощью этих клеток удалите 10 микролитров клеточной суспензии и распределите ее на свежем микроскопе. Скользить.

Накройте каплю защитным стеклом и нанесите каплю масла на поверхность защитного стекла. Затем вручную закройте затвор на пути лазерного луча, чтобы не допустить попадания лазерного света к объективу микроскопа. Закрепите предметное стекло микроскопа на ступенях для перемещения XY, Z и перемещайте предметное стекло в направлении оптической оси до тех пор, пока объектив микроскопа не соприкоснется с каплей иммерсионного масла.

Теперь включаем широкоугольную подсветку света и переходим к камере. Видеорежим сбора данных. Широкопольное изображение образца будет сильно размыто из-за наличия просвечивающей решетки в тракте излучения.

Поэтому поместите полосовой фильтр с небольшой шириной в половину максимума в оптическом тракте, предшествующем решетке пропускания. Медленно перемещайте этап трансляции в направлении оптической оси, просматривая изображение ячеек на экране камеры, пока ячейки не окажутся в фокусе. Переместите предметный столик в направлении X или Y, чтобы привести одну ячейку к месту фокусировки лазерного луча.

Выключите широкопольный источник освещения и снимите полосовой фильтр с пути излучения. Разблокируйте лазерный луч на короткое время, одновременно просматривая сигнал, полученный на ПЗС-матрице. Если флуоресцентный сигнал обнаружен на ПЗС-матрице в то время, когда лазерный луч падает на клетку, то выполните полное сканирование этой ячейки для сбора флуоресцентных данных.

Очень важно использовать те же параметры сканирования, в частности, количество строк и почему приращение, как определено в процедуре калибровки, продемонстрированной ранее. Повторите процесс определения местоположения клеток и получения данных флуоресценции для большого числа клеток, экспрессирующих белок, прикрепленных как к донорским, так и к акцепторным меткам. После накопления достаточного количества флуоресцентных изображений клеток, экспрессирующих белки, помеченные обоими рецепторами, повторите весь процесс для обеих клеток, экспрессирующих только белки, помеченные донорскими флуоресцентными зондами, и клеток, экспрессирующих только белки, помеченные акцепторными флуоресцентными зондами.

Наконец, восстановите все сканы, чтобы получить спектральное разрешение. Пространственные карты интенсивности флуоресценции XY для каждого набора данных с использованием процедуры, описанной ранее на этих трех рисунках, представляют собой результирующие пространственные карты, рассчитанные на основе измерений двухфотонной микроскопии со спектральным разрешением, выполненных на дрожжевой клетке, экспрессирующей рецептор стерильного альфа-фактора. Двухмерные карты сигналов донора и акцептора были получены в результате анализа спектральных профилей излучения, полученных из каждого места ячейки.

Интенсивности флуоресценции присваиваются ложные цвета в соответствии с их значениями, а шкала отображается в виде вставки. Затем была рассчитана двумерная карта кажущейся эффективности ладов с использованием изображений KDA и KAD с использованием значений, извлеченных из карты видимой эффективности ладов только что показанной ячейки, был подготовлен график гистограммы. Измеренные значения EAPP ячейки представлены кружками.

Красная сплошная линия представляет наилучшее соответствие измеренным данным с использованием суммы отдельных функций кальция, представленных сплошными зелеными линиями. Анализ гистограммы, которая описана в тексте протокола, подтверждает, что стерильный двухфакторный рецептор всех связок приобретает форму тетрамера в форме RBA in vivo. После освоения этой техники ее можно выполнить за 12 часов при правильном выполнении.

При проведении этого эксперимента важно поддерживать низкую мощность источника возбуждения. Важно избегать многократного возбуждения донора одним импульсом.