Характеристика генетически модифицированных мезенхимальных стволовых клеток для применения в нейротерапии
JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 3:23 мин • August 7th, 2025
Начнем с трансгенных мезенхимальных стволовых клеток мышей — мультипотентных клеток, полученных из костного мозга.
Клетки спроектированы таким образом, чтобы экспрессировать GFP и терапевтические нейротрофические факторы, которые поддерживают рост и выживание нейронов.
Промойте клетки буфером и зафиксируйте их, чтобы сохранить клеточную целостность.
Снова промойте буфером, затем добавьте раствор для проникновения в клеточные и ядерные мембраны и блокирования неспецифических сайтов связывания.
Введение первичных антител, нацеленных на белок-маркер пролиферации клеток, экспрессируемый исключительно в ядре делящихся клеток.
Промойте буфером, чтобы удалить несвязанные антитела.
Добавьте флуорофор-конъюгированные вторичные антитела, нацеленные на первичные антитела, и ДНК-связывающий краситель для противостояния ядрам.
Промойте буфером, чтобы удалить несвязанные реагенты.
Загрузите пластину в систему скрининга с высоким содержанием содержимого и сделайте снимки для обнаружения флуоресцентных сигналов.
Экспрессия маркера пролиферации клеток указывает на активное деление клеток, что свидетельствует о пригодности трансгенных клеток для применения в нейротерапии.
Для проведения анализа пролиферации клеток Ki-67 используйте 0,1 молярного фосфатного буфера для промывания клеточных культур в течение одной минуты. После повторения промывки используйте 4% параформальдегид, или PFA, при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы закрепить культуры.
После фиксации извлеките PFA и с помощью PBS промойте лунки три раза по семь минут каждая. После блокировки клеток согласно текстовому протоколу нанесите в каждую лунку по 100 микролитров раствора первичного антитела. Накройте тарелку крышкой и выдерживайте при температуре 4 градуса Цельсия в течение ночи.
После промывки клеток три раза в течение семи минут для каждого промывки нанесите вторичное антитело, поместите клетки в темноту и инкубируйте при комнатной температуре в течение 90 минут. После еще трех стирок накройте пластину крышкой и храните ее при температуре 4 градуса Цельсия до визуализации.
Чтобы выполнить автоматическую визуализацию, загрузите иммуномаркированную пластину в систему HCS и дайте планшету уравновеситься в течение 20 минут. Откройте программное обеспечение для сбора и анализа изображений системы HCS. Выберите настройки съемки для объектива 10X с помощью объединения камер в точке 1 и настройке усиления в точке 2.
Используйте функцию автоматической экспозиции, чтобы найти плоскость Z, в которой находятся клетки, и рассчитать смещение для каждой интересующей вас длины волны. Для продемонстрированного здесь анализа захватите изображения для DAPI, GFP и Cy3.
Выберите максимальный уровень интенсивности, при котором отрицательные контрольные лунки не показывают сигнал для получения изображения. Используйте те же пороговые настройки для положительных скважин. Наконец, захватите изображения и сохраните их в базе данных, прежде чем выполнять анализ изображений в соответствии с текстовым протоколом.
Обзор
Данное исследование сосредоточено на использовании мезенхимальных стволовых клеток трансгенных мышей, модифицированных для экспрессии GFP и нейротрофических факторов. Методология включает методы иммунофлуоресценции для оценки пролиферации клеток, что указывает на их потенциал для применения в нейротерапии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Клеточная биология
- Исследования стволовых клеток
Теоретические сведения
- Трансгенные мезенхимальные стволовые клетки мыши выделяют из костного мозга.
- Эти клетки способны поддерживать рост и выживаемость нейронов.
- Иммунофлуоресценция является ключевым методом визуализации клеточных компонентов.
- Маркеры пролиферации клеток необходимы для оценки деления клеток.
Цель исследования
- Оценить пролиферацию модифицированных мезенхимальных стволовых клеток.
- Определить пригодность данных клеток для применения в нейротерапии.
- Использовать высокопроизводительный скрининг для анализа изображений пролиферации клеток.
Используемые методы
- Трансгенные мезенхимальные стволовые клетки мыши были модифицированы для экспрессии GFP.
- Клетки фиксировали, пермеабилизировали и блокировали для связывания антител.
- Для детектирования маркеров пролиферации клеток применяли первичные и вторичные антитела.
- Автоматизированная визуализация проводилась с использованием системы высокопроизводительного скрининга.
Основные результаты
- Экспрессия маркеров клеточной пролиферации указывала на активное деление клеток.
- С помощью иммунофлуоресценции удалось визуализировать пролиферацию стволовых клеток.
- Скрининг с высоким содержанием данных позволил получить количественные показатели пролиферации клеток.
- Данная методология продемонстрировала терапевтический потенциал этих клеток.
Выводы
- Трансгенные мезенхимальные стволовые клетки пригодны для применения в нейротерапии.
- Иммунофлуоресценция и высокопроизводительный скрининг эффективности являются действенными методами оценки пролиферации клеток.
- Данное исследование вносит вклад в понимание поведения стволовых клеток в нейробиологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Оценка пролиферации генетически модифицированных мезенхимальных стволовых клеток позволяет с уверенностью прогнозировать их пригодность для применения в нейротерапевтических целях. Этот метод высококонтентного анализа способствует валидации мишеней, подтверждая функциональную активность клеток, экспрессирующих терапевтический фактор. Он позволяет снизить механистические риски на ранних этапах поиска, связывая экспрессию трансгена с пролиферативной способностью, что служит основанием для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки терапии на основе стволовых клеток.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: подтверждает, что экспрессия трансгена коррелирует с пролиферативной активностью, что служит доказательством функциональной валидации модифицированных стволовых клеток.
- Практическая ценность: позволяет проводить количественную оценку пролиферации клеток с помощью иммунофлуоресценции и высокопроизводительного скрининга.
- Прогностическая ценность: повышенная экспрессия маркера пролиферации указывает на пригодность клеток для использования в нейротерапии, что повышает уверенность в выборе мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Создание воспроизводимого метода иммунофлуоресцентного анализа для детектирования маркеров пролиферации в популяциях стволовых клеток.
- Практическая ценность: Система высокопроизводительного скрининга позволяет регистрировать флуоресцентные сигналы для стандартизированного и масштабируемого анализа.
- Готовность анализа: Протокол включает этапы фиксации, пермеабилизации, блокировки и многоступенчатой инкубации с антителами для обеспечения надежного окрашивания.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Характеристические клетки, экспрессирующие нейротрофические факторы, поддерживают рост и выживаемость нейронов, что соответствует нейропротекторным стратегиям.
- Значимость доклинической модели: Оценка пролиферации обеспечивает достаточное расширение популяции клеток для терапевтического дозирования.
- Продвижение с учетом рисков: Валидированная пролиферация коррелирует с однородностью партий и масштабируемостью производства.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум исследований от валидации мишени до доклинической разработки, поддерживая рабочие процессы инженерии стволовых клеток для создания нейротерапевтических средств.
- Открытия в биологии: Иммунофлуоресценция позволяет выявлять маркеры пролиферации ядер, что дает возможность проверить гипотезу о функциональности трансгена.
- Скрининг: Высокопроизводительный скрининг обеспечивает количественные результаты на основе изображений для стандартизации и воспроизводимости анализа.
- Аналитика: Регистрация флуоресцентного сигнала в каналах DAPI, GFP и Cy3 позволяет проводить многопараметрический анализ модифицированных клеток.
- Трансляционные исследования: Данные о пролиферации обосновывают решения о дальнейшем продвижении разработки, подтверждая жизнеспособность клеток для терапевтического применения.
- Корпоративное повторное использование: Стандартизированный протокол характеризации позволяет использовать данный метод для различных линий стволовых клеток и конструкций терапевтических факторов.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Повышение предсказуемости функциональности стволовых клеток посредством валидации экспрессии трансгена, связанной с пролиферацией.
- Практическая ценность: Стандартизированная иммунофлуоресценция и высокопроизводительный скрининг обеспечивают воспроизводимость результатов в различных лабораториях.
- Стратегическая ценность: Позволяет проводить приоритизацию кандидатов из стволовых клеток с учетом рисков, снижая вероятность биологических неудач на поздних этапах.
- Влияние на портфель: Обеспечивает возможность принятия решений о дальнейшем продвижении на основе количественных показателей пролиферации.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с иммунофлуоресцентным окрашиванием, валидацией антител и флуоресцентной микроскопией.
- Зависит от системы высокопроизводительного скрининга с возможностями автоматического сбора и анализа изображений.
- Необходима стандартизация этапов фиксации, пермеабилизации и блокирования для различных клеточных линий.
- При адаптации метода следует учитывать совместимость антител и оптимизацию сигнала для разных маркеров пролиферации.
- Практические ограничения включают возможную вариабельность при инкубации с первичными антителами и эффективности промывки.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Выделение и характеристика мезенхимальных стромальных клеток из пуповинной и фетальной плаценты
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение и идентификация мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани крыс породы Sprague Dawley
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение, экстракорпоральная экспансия и характеристика мезенхимальных стволовых клеток из эпидидимальной жировой ткани яичка мыши
Похожие видео
0 Просмотры
Трансплантация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных Мезоангиобласт-как миогенные прогениторы в мышиных моделях мышечной регенерации
Похожие видео
0 Просмотры
Системная Инъекция стволовых нервных / клеток-предшественников у мышей с хроническим ЕАЕ
Похожие видео
0 Просмотры
Высокая пропускная способность Характеристика взрослых стволовых клеток разработан для доставки терапевтических факторов для Нейропротекторное стратегий
Похожие видео
0 Просмотры
Дифференциация человеческих нервных стволовых клеток линии на трехмерной культур, анализ микроРНК и предполагаемые гены-мишени
Похожие видео
0 Просмотры
Гипоксическое предварительное кондиционирование клеток-предшественников, полученных из костного мозга, в качестве источника для генерации зрелых клеток Шванна
Похожие видео
0 Просмотры
Интраназальная доставка терапевтических стволовых клеток в глиобластому в модели мыши
Похожие видео
0 Просмотры
Изображение руководствуясь резекции глиобластома и внутричерепных имплантации терапевтического стволовых клеток посеян подмостей
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026