Характеристика генетически модифицированных мезенхимальных стволовых клеток для применения в нейротерапии

Начнем с трансгенных мезенхимальных стволовых клеток мышей — мультипотентных клеток, полученных из костного мозга.

Клетки спроектированы таким образом, чтобы экспрессировать GFP и терапевтические нейротрофические факторы, которые поддерживают рост и выживание нейронов.

Промойте клетки буфером и зафиксируйте их, чтобы сохранить клеточную целостность.

Снова промойте буфером, затем добавьте раствор для проникновения в клеточные и ядерные мембраны и блокирования неспецифических сайтов связывания.

Введение первичных антител, нацеленных на белок-маркер пролиферации клеток, экспрессируемый исключительно в ядре делящихся клеток.

Промойте буфером, чтобы удалить несвязанные антитела.

Добавьте флуорофор-конъюгированные вторичные антитела, нацеленные на первичные антитела, и ДНК-связывающий краситель для противостояния ядрам.

Промойте буфером, чтобы удалить несвязанные реагенты.

Загрузите пластину в систему скрининга с высоким содержанием содержимого и сделайте снимки для обнаружения флуоресцентных сигналов.

Экспрессия маркера пролиферации клеток указывает на активное деление клеток, что свидетельствует о пригодности трансгенных клеток для применения в нейротерапии.

Для проведения анализа пролиферации клеток Ki-67 используйте 0,1 молярного фосфатного буфера для промывания клеточных культур в течение одной минуты. После повторения промывки используйте 4% параформальдегид, или PFA, при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы закрепить культуры.

После фиксации извлеките PFA и с помощью PBS промойте лунки три раза по семь минут каждая. После блокировки клеток согласно текстовому протоколу нанесите в каждую лунку по 100 микролитров раствора первичного антитела. Накройте тарелку крышкой и выдерживайте при температуре 4 градуса Цельсия в течение ночи.

После промывки клеток три раза в течение семи минут для каждого промывки нанесите вторичное антитело, поместите клетки в темноту и инкубируйте при комнатной температуре в течение 90 минут. После еще трех стирок накройте пластину крышкой и храните ее при температуре 4 градуса Цельсия до визуализации.

Чтобы выполнить автоматическую визуализацию, загрузите иммуномаркированную пластину в систему HCS и дайте планшету уравновеситься в течение 20 минут. Откройте программное обеспечение для сбора и анализа изображений системы HCS. Выберите настройки съемки для объектива 10X с помощью объединения камер в точке 1 и настройке усиления в точке 2.

Используйте функцию автоматической экспозиции, чтобы найти плоскость Z, в которой находятся клетки, и рассчитать смещение для каждой интересующей вас длины волны. Для продемонстрированного здесь анализа захватите изображения для DAPI, GFP и Cy3.

Выберите максимальный уровень интенсивности, при котором отрицательные контрольные лунки не показывают сигнал для получения изображения. Используйте те же пороговые настройки для положительных скважин. Наконец, захватите изображения и сохраните их в базе данных, прежде чем выполнять анализ изображений в соответствии с текстовым протоколом.