Простой протокол Chelex для выделения ДНК из Anopheles SPP.
9 января 2013 г.
Быстрый и доступный способ извлечения паразита малярии качества и векторной ДНК из образцов комаров описано. Опираясь на свойства хелатирующие смолы Chelex, простой метод позволяет генотипирования малярийных паразитов в комара средней кишки и слюнных желез фаз, а также молекулярная идентификация Anopheles Видов-двойников с помощью ПЦР.
Общая цель этой процедуры заключается в извлечении ДНК малярии, паразитов и комаров из участков средней кишки и слюнных желез аномалий, образцов. Это достигается путем предварительного разрезания комара точно в месте стыка между брюшной полостью и грудной клеткой, тем самым отделяя среднюю кишку от участка слюнных желез. Далее каждая секция измельчается отдельно в деионизированной воде.
Затем тканевую суспензию ложат и промывают и восстанавливают клеточную гранулу. Наконец, клеточную гранулу восстанавливают и кипятят, а ДНК извлекают. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие высокое качество ДНК комаров и малярийных паразитов, пригодных для использования в качестве матрицы для идентификации аномалий, видов переносчиков и генотипов малярийных инфекций с помощью ПЦР и переваривания аллель-специфических ферментов рестрикции.
Таким образом, основное преимущество этого очень простого метода перед существующими, такими как методы органической экстракции и сортировки, заключается в том, что он использует очень мало безопасных и легкодоступных реагентов, а также гораздо меньше времени на обработку. Чтобы начать препарирование комара, поместите его на небольшой кусочек параформы и установите его на препарирующий микроскоп. Покройте его каплей деионизированной воды.
Чтобы размягчить ткани в размерах, тушку комара располагают точно в месте соединения между грудной клеткой и брюшной полостью. Таким образом, отрезаются голова и грудная клетка от брюшной полости. Переложите каждый препарированный срез комара в чистую автоклавную микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитра, предварительно помеченную идентификационным номером комара и срезом тела, выбросьте парапленку и с помощью 70% смоченной спиртом салфетки Кима тщательно протрите столик микроскопа перед обработкой следующего комара для извлечения ДНК комара первой пипеткой 20 микролитров деионизированной воды в пробирку для образца.
И с помощью наконечника пипетки измельчите погруженную секцию комара в однородную суспензию. Добавьте 100 микролитров автоклава, один XPBS 1%-ный раствор сапонина в образец гомогенат и аккуратно перемешайте. Инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 20 минут.
Затем центрифугируйте при 20 000 G в течение двух минут и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах одного XPBS. Затем повторите спин.
Добавьте 75 микролитров стерильной деионизированной воды и 25 микролитров 20% веса на объем. Смола Cellex 100 суспензируется в деионизированной воде и мягко вихревая суспендирует гранулу с помощью стерильной иглы для подкожных инъекций 23 калибра, подожженной в горелке Бунзена. Проткните отверстие в крышке пробирки с образцом.
Прокипятить образец суспензии в нагревательном блоке в течение 10 минут. Центрифугируйте при 20 000 G в течение одной минуты и перенесите раствор ДНК в предварительно помеченный флакон для хранения для использования в качестве матрицы в ПЦР-реакциях для проверки качества экстрагированной ДНК, амплифицируйте область гена субъединицы 4 митохондриальной никотинамидаденунитриндегидрогеназы членистоногих, которая, как ожидается, продуцирует фрагмент 400 пары оснований. Далее, чтобы дифференцировать виды Ananais Gambia, амплифицируйте область, фланкирующую SNP в области межгенного спейсера, которая, как ожидается, будет производить размеры 390 пар оснований для Ananais Gambia Sens Stricto и 315 пар оснований для Ananais api.
Ansis затем к генотипу p falciparum антифолиевой лекарственной устойчивости полиморфизмов. Проводят вложенную ПЦР для амплификации области, фланкирующей кодоны аминокислот 16, 51, 59, 108 и 164. У паразитов ген дигидрофолитередуктазы осуществляет аллель-специфическое расщепление ампликона для выявления устойчивости к антифолатным препаратам.
Ассоциированные полиморфизмы. Проверьте реакцию на гелевый тест 2%AROS. Примеры результатов ПЦР-анализов на качество ДНК комаров Analis RABIS молекулярная идентификация и генотипирование p falciparum показывают, что упрощенный метод Kelex дает результаты, аналогичные стандартному протоколу высаивания, несмотря на меньшее количество этапов и менее чем в четыре раза чаще с сопоставимым качеством ДНК в соответствующих экстрактах, неудивительно, что показатели положительности образцов в отношении аномалий, Виды братьев и сестер в Гамбии, а также частота заражения паразитами статистически не отличались на основе критерия хи-квадрат Макнира.
Добавление БСА в реакционные смеси приводит к общему увеличению положительных результатов ПЦР из-за удаления ингибиторов ПЦР как по упрощенному протоколу kelex, так и по протоколу регулярного высоливания. Тем не менее, это увеличение не было статистически значимым, за исключением качества ДНК в экстрактах келекса. Расщепление аллель-специфического фермента рестрикции P. falciparum amplicon позволяет генотипировать малярийные инфекции средней кишки и слюнных желез по аллелям лекарственной устойчивости после освоения.
Эта техника должна быть выполнена примерно за 37 минут при правильном выполнении.
Обзор
В данной статье описывается быстрый и доступный метод выделения высококачественной ДНК из паразитов малярии и комаров-переносчиков. Благодаря использованию смолы Chelex данный метод позволяет эффективно проводить генотипирование паразитов малярии и молекулярную идентификацию видов Anopheles.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Геномика
Теоретические сведения
- Малярия представляет собой серьезную проблему для глобального здравоохранения; переносчиками заболевания являются комары Anopheles.
- Традиционные методы экстракции ДНК могут быть трудоемкими и требовать использования опасных реагентов.
- Существует потребность в более простых, безопасных и эффективных методах экстракции ДНК.
- В данном исследовании представлен метод, отвечающий этим требованиям, с использованием смолы Chelex.
Цель исследования
- Разработать быстрый и экономичный метод экстракции ДНК из паразитов малярии и комаров-переносчиков.
- Обеспечить возможность генотипирования паразитов малярии и идентификации видов Anopheles.
- Сравнить эффективность и результативность нового метода с традиционными протоколами.
Используемые методы
- Препарирование экземпляров комаров для отделения отделов средней кишки и слюнных желез.
- Измельчение тканей в деионизированной воде для получения суспензии.
- Использование смолы Chelex для экстракции ДНК.
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для генотипирования и видовой идентификации.
Основные результаты
- Метод с использованием Chelex позволяет получить высококачественную ДНК, подходящую для ПЦР.
- Результаты сопоставимы с традиционными методами при значительном сокращении времени обработки.
- Показатели положительных проб при идентификации видов и выявлении паразитарных инфекций были статистически схожими для обоих методов.
- Добавление BSA улучшило результаты ПЦР за счет снижения влияния ингибиторов.
Выводы
- Упрощенный метод Chelex эффективен для экстракции ДНК из переносчиков малярии.
- Данная методика может быть выполнена менее чем за 40 минут, что делает ее практичной для рутинного использования.
- Она представляет собой более безопасную и эффективную альтернативу традиционным методам экстракции ДНК.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
В условиях ограниченных ресурсов устойчивый молекулярный мониторинг переносчиков и паразитов малярии требует методов экстракции ДНК, в которых эффективность сочетается с простотой выполнения. Протокол на основе Chelex обеспечивает качество ДНК, сопоставимое с общепринятыми методами высаливания, сокращая при этом количество необходимых реагентов и время обработки с почти трех часов до менее чем 40 минут. Это делает данный метод практичным инструментом для реализации масштабируемых и экономически эффективных рабочих процессов по генотипированию и идентификации видов в рамках исследовательских и контрольных программ в эндемичных регионах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет исследовать взаимодействие переносчика и паразита, предоставляя матрицы ДНК для подтверждения вида и оценки статуса инфицирования.
- Практическая ценность: сокращает время непосредственной работы и расход реагентов, обеспечивая более высокую пропускную способность при обработке образцов, собранных в полевых условиях.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать ДНК, подходящую для ПЦР-анализов, направленных на дифференциацию видов переносчиков и генотипирование паразитов.
- Практическая ценность: используются всего три реагента (деионизированная вода, сапонин, смола Chelex), что способствует стандартизации анализа и снижает вариативность в лабораториях с ограниченными ресурсами.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает непрерывность процесса от сбора переносчиков до последующих приложений, таких как генотипирование лекарственной устойчивости с помощью вложенной ПЦР и рестрикционного анализа.
- Практическая ценность: Исключает необходимость в использовании опасных органических растворителей, что повышает безопасность и доступность метода в полевых лабораториях.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Данный метод является частью общего цикла исследований — от подготовки образцов до генетического анализа, что обеспечивает получение надежного материала для идентификации и генотипирования с помощью ПЦР.
- Открытийная биология: способствует проверке гипотез о распределении видов переносчиков и показателях инфицирования Plasmodium falciparum в полевых условиях.
- Скрининг: обеспечивает получение экстрактов ДНК достаточного качества и выхода для применения мультиплексной ПЦР, что гарантирует готовность анализа.
- Аналитика: позволяет проводить количественную оценку посредством ПЦР-амплификации ND4, видоспецифичных SNP и локусов лекарственной устойчивости, что дает возможность сравнивать различные группы образцов.
- Трансляционные исследования: связывают энтомологический надзор с генотипированием паразитов, поддерживая принятие решений с учетом рисков в стратегиях борьбы с малярией.
- Корпоративное повторное использование: простота протокола и минимальные требования к оборудованию (микроцентрифуга, нагревательный блок) позволяют внедрить метод на нескольких полевых участках и в различных исследовательских группах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую достоверность при идентификации видов переносчиков и обнаружении паразитов благодаря чувствительности и специфичности, сопоставимым с эталонными методами.
- Операционная ценность: обеспечивает высокую воспроизводимость при минимальной зависимости от реагентов, что снижает уязвимость цепочек поставок в удаленных регионах.
- Стратегическая ценность: позволяет быстрее принимать решения о продолжении или прекращении работ (go/no-go) в программах эпидемиологического надзора за счет сокращения времени получения результатов молекулярного подтверждения.
- Влияние на портфель проектов: способствует приоритизации мероприятий с учетом рисков за счет предоставления своевременных и точных данных о векторной компетенции и распространенности паразитов.
Особенности реализации
- Требуется базовое обучение методам молекулярной биологии для препарирования тканей, гомогенизации и постановки ПЦР.
- Необходим доступ к микроцентрифуге, способной развивать ускорение 20,000 × g, и к нагревательному блоку для этапа кипячения.
- Для стандартизации результатов между группами исследователей рекомендуется использовать единообразные методы вортексирования и пипетирования при гомогенизации и ресуспендировании смолы.
- Адаптация метода для других видов комаров или типов образцов может потребовать валидации эффективности лизиса и удаления ингибиторов.
- Практическое ограничение: метод включает этап ручного измельчения, что без модификации может ограничить автоматизацию при сверхвысокой пропускной способности.
