Простой протокол Chelex для выделения ДНК из Anopheles SPP.

Общая цель этой процедуры заключается в извлечении ДНК малярии, паразитов и комаров из участков средней кишки и слюнных желез аномалий, образцов. Это достигается путем предварительного разрезания комара точно в месте стыка между брюшной полостью и грудной клеткой, тем самым отделяя среднюю кишку от участка слюнных желез. Далее каждая секция измельчается отдельно в деионизированной воде.

Затем тканевую суспензию ложат и промывают и восстанавливают клеточную гранулу. Наконец, клеточную гранулу восстанавливают и кипятят, а ДНК извлекают. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие высокое качество ДНК комаров и малярийных паразитов, пригодных для использования в качестве матрицы для идентификации аномалий, видов переносчиков и генотипов малярийных инфекций с помощью ПЦР и переваривания аллель-специфических ферментов рестрикции.

Таким образом, основное преимущество этого очень простого метода перед существующими, такими как методы органической экстракции и сортировки, заключается в том, что он использует очень мало безопасных и легкодоступных реагентов, а также гораздо меньше времени на обработку. Чтобы начать препарирование комара, поместите его на небольшой кусочек параформы и установите его на препарирующий микроскоп. Покройте его каплей деионизированной воды.

Чтобы размягчить ткани в размерах, тушку комара располагают точно в месте соединения между грудной клеткой и брюшной полостью. Таким образом, отрезаются голова и грудная клетка от брюшной полости. Переложите каждый препарированный срез комара в чистую автоклавную микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитра, предварительно помеченную идентификационным номером комара и срезом тела, выбросьте парапленку и с помощью 70% смоченной спиртом салфетки Кима тщательно протрите столик микроскопа перед обработкой следующего комара для извлечения ДНК комара первой пипеткой 20 микролитров деионизированной воды в пробирку для образца.

И с помощью наконечника пипетки измельчите погруженную секцию комара в однородную суспензию. Добавьте 100 микролитров автоклава, один XPBS 1%-ный раствор сапонина в образец гомогенат и аккуратно перемешайте. Инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 20 минут.

Затем центрифугируйте при 20 000 G в течение двух минут и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах одного XPBS. Затем повторите спин.

Добавьте 75 микролитров стерильной деионизированной воды и 25 микролитров 20% веса на объем. Смола Cellex 100 суспензируется в деионизированной воде и мягко вихревая суспендирует гранулу с помощью стерильной иглы для подкожных инъекций 23 калибра, подожженной в горелке Бунзена. Проткните отверстие в крышке пробирки с образцом.

Прокипятить образец суспензии в нагревательном блоке в течение 10 минут. Центрифугируйте при 20 000 G в течение одной минуты и перенесите раствор ДНК в предварительно помеченный флакон для хранения для использования в качестве матрицы в ПЦР-реакциях для проверки качества экстрагированной ДНК, амплифицируйте область гена субъединицы 4 митохондриальной никотинамидаденунитриндегидрогеназы членистоногих, которая, как ожидается, продуцирует фрагмент 400 пары оснований. Далее, чтобы дифференцировать виды Ananais Gambia, амплифицируйте область, фланкирующую SNP в области межгенного спейсера, которая, как ожидается, будет производить размеры 390 пар оснований для Ananais Gambia Sens Stricto и 315 пар оснований для Ananais api.

Ansis затем к генотипу p falciparum антифолиевой лекарственной устойчивости полиморфизмов. Проводят вложенную ПЦР для амплификации области, фланкирующей кодоны аминокислот 16, 51, 59, 108 и 164. У паразитов ген дигидрофолитередуктазы осуществляет аллель-специфическое расщепление ампликона для выявления устойчивости к антифолатным препаратам.

Ассоциированные полиморфизмы. Проверьте реакцию на гелевый тест 2%AROS. Примеры результатов ПЦР-анализов на качество ДНК комаров Analis RABIS молекулярная идентификация и генотипирование p falciparum показывают, что упрощенный метод Kelex дает результаты, аналогичные стандартному протоколу высаивания, несмотря на меньшее количество этапов и менее чем в четыре раза чаще с сопоставимым качеством ДНК в соответствующих экстрактах, неудивительно, что показатели положительности образцов в отношении аномалий, Виды братьев и сестер в Гамбии, а также частота заражения паразитами статистически не отличались на основе критерия хи-квадрат Макнира.

Добавление БСА в реакционные смеси приводит к общему увеличению положительных результатов ПЦР из-за удаления ингибиторов ПЦР как по упрощенному протоколу kelex, так и по протоколу регулярного высоливания. Тем не менее, это увеличение не было статистически значимым, за исключением качества ДНК в экстрактах келекса. Расщепление аллель-специфического фермента рестрикции P. falciparum amplicon позволяет генотипировать малярийные инфекции средней кишки и слюнных желез по аллелям лекарственной устойчивости после освоения.

Эта техника должна быть выполнена примерно за 37 минут при правильном выполнении.