Эффективное использование Иммунопреципитация хроматина Ограничение количество биомассы

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы обнаружить либо связывание ДНК-связывающих белков, таких как факторы транскрипции, либо его каменные модификации. Это достигается путем предварительного приготовления хроматина в качестве второго этапа. Реакция иммунопреципитации хроматина направлена на извлечение фрагментов ДНК, связанных с интересующим белком.

Далее фрагмент ДНК, связанный с интересующим белком, амплифицируют с помощью ПЦР. Получены результаты, которые показывают кратное обогащение фрагмента ДНК, связанного с интересующим белком, по сравнению с несвязанной областью на основе анализа QPCR. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области транскрипции, хроматина и эпигенетики, например, когда и где присутствуют различные модифицированные или немодифицированные белки.

Однако этот метод может дать представление о регуляции генов Т-клеток. Он также может быть применен к другим системам, таким как В-лимфоциты, образцы лейкемии и иммортализированные линии клеток. Хроматин для этого эксперимента будет получен из наивных CD четырех Т-клеток мышиной селезенки.

Чтобы начать эту процедуру, добавьте 37% формальдегида до конечной концентрации 1% в суспензию CD четырех Т-клеток в DMEM и осторожно покачивайте при комнатной температуре в течение 15 минут. Это позволит сшивать белковые комплексы ДНК. Остановите сшивку, добавив один молярный глицин до конечной концентрации 125 миллимоляров.

Продолжайте раскачивать в течение пяти минут при комнатной температуре. Соберите клетки центрифугированием при 200 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в пяти миллилитрах ледяного PBS, содержащего ингибиторы протеазы, снова центрифугуйте, промойте клетки таким образом в общей сложности три раза после окончательной промывки, выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре ледяного буфера для лизиса клеток, содержащего ингибиторы протеазы.

Переложите клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 миллилитра и инкубируйте на льду в течение 15 минут. Соберите ядра центрифугированием при температуре 200 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Осторожно отбросьте надосадочную жидкость, чтобы ресуспендировать ядра в 500 микролитрах ядерного лизиса.

Буфер, содержащий ингибиторы протеазы, инкубируют на льду в течение 15 минут. Затем произведите ультразвуковую обработку клеток с помощью 1,6-миллиметрового зонда и выходного уровня 4 ультразвука в течение 15 секунд. Охладите образец на льду в течение одной-двух минут, чтобы предотвратить перегрев, и снова проведите ультразвуковую обработку в течение 15 секунд.

Повторите ультразвуковую обработку и охлаждение в общей сложности четыре раза центрифугой, звуковой хроматин при 16 000 G в течение пяти минут. В четыре четыре градуса по Цельсию. Соберите прозрачную надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку.

Удалите аликвоту на 20 микролитров прозрачной надосадочной жидкости. Добавьте краситель, загружающий ДНК, и проверьте ультразвуковую ДНК методом электрофореза через 2%-ный агрогель. Идеальный размер ультразвуковой ДНК для большинства применений составляет от 200 до 500 пар оснований.

Наконец, определите концентрацию ДНК с помощью УФ-спектрофотометра. Срезанный хроматин можно использовать немедленно для запуска реакции иммунопреципитации хроматина или хранить при температуре минус 80 градусов Цельсия для иммунопреципитации хроматина или разбавлять хроматин ультразвуком до концентрации ДНК от пяти до 10 мкг на миллилитр в общем объеме два миллилитра в буфере для разведения чипа с ингибиторами протеазы. Все этапы в этой процедуре должны проводиться при температуре от нуля до четырех градусов по Цельсию.

Сэкономьте 10%, что составляет 200 микролитров в этом примере разбавленного ультразвуком хроматина в качестве входа, храните на льду оставшийся образец аликвоты 450 микролитров в каждой из четырех 1,7-миллилитровых микропробирок, помеченных как изотип контроля и антитела, представляющие интерес. Если используется несколько антител одного и того же изотипа, будет достаточно одного контроля изотипа. Для проведения этого анализа добавьте от двух до пяти микрограммов специфического антитела в зависимости от специфичности используемого антитела или контроля изотипа в соответствующие пробирки. Покачивайте трубки на ночь при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы на следующее утро образовались комплексы антител к хроматину.

Добавьте 25 микролитров магнитных шариков белка G в каждую смесь и раскачивайте не менее двух часов при температуре четыре градуса Цельсия. Затем поместите пробирки на магнитную подставку на 15-20 секунд, чтобы шарики собрались на намагниченной стороне. Осторожно удалите раствор методом аспирации, не потревожив шарики.

Добавьте один миллилитр раствора для промывки с низким содержанием соли и аккуратно покачивайте в течение пяти минут на мутаторе. Соберите бусины с помощью магнитной подставки и удалите раствор для стирки. Добавьте один миллилитр раствора для промывки с низким содержанием соли еще раз и аккуратно покачивайте в течение пяти минут.

После удаления раствора для промывки с низким содержанием соли добавьте один миллилитр раствора для промывки с высоким содержанием соли и раскачивайте в течение пяти минут. Соберите бусины с помощью магнитной подставки и удалите раствор для стирки. Повторите стирку раствором для промывки с высоким содержанием соли.

Как только удалите раствор для промывки с высоким содержанием соли, добавьте один миллилитр раствора для промывки хлорида лития и покачивайтесь в течение пяти минут. Соберите бусины с помощью магнитной подставки и удалите раствор для стирки. Повторите промывку хлоридом лития один раз.

Добавьте один миллилитр раствора TE и покачивайте в течение пяти минут. Соберите бусины с помощью магнитной подставки и удалите раствор для стирки. Вымывайте ДНК из бусин, добавляя 250 микролитров элюцианской буферной породы в течение 15 минут при комнатной температуре.

Отпишьте ЭИТ и сохраните этот материал в новой 1,7-миллиметровой пробирке. Повторите еще раз и объедините оба элу, выбросьте бусины, чтобы перевернуть поперечные связи. Добавьте к ускользающей ДНК пять моляров хлорида натрия до конечной концентрации 0,3 моляра и один микролитр РНК.

A Добавьте 400 микролитров буфера элюирования к ранее сохраненным входам. Чтобы получить объем 500 микролитров на каждый вход, добавьте в 0,3 моляра хлорид натрия, один микролитр РНК, 10 микролитров 0,5 моляра ЭДТА, 20 микролитров одного молярного триса, HCL pH 6,5 и один микролитр протеиназы К. Запечатайте пробирки и инкубируйте их на ночь при температуре 65 градусов Цельсия в сухом нагревательном блоке на следующее утро, Дайте трубкам остыть до комнатной температуры. Затем добавьте один миллилитр 100% этанола и выдерживайте в течение двух часов до ночи при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Для осаждения ДНК-центрифуги пробирки при 16 000 G в течение 15 минут. Для гранулирования ДНК промойте гранулу ДНК однократно с 70% этанолом и высушите на воздухе, гранулу восстановите, поместите ДНК в 100 микролитров автоклавной дистиллированной воды, очистите ДНК с помощью каяка, быстрого отжима колонок и элюируйте в общем объеме 50 микролитров элюирующего буфера. Теперь эта ДНК готова к использованию для амплификации ПЦР.

Анализ запасов КПКР для получения полного обогащения по контрольной несвязанной области является наиболее важным аспектом данного протокола. С помощью программного обеспечения QPCR перейдите в редактор и отметьте лунки, содержащие входные образцы различных разведений, их стандартными значениями кривой. Также пометьте лунки неизвестными образцами чипов точно так же, как выложена ПЦР-планшет.

Использование стандартной кривой для интерполяции количеств ДНК в неизвестных специфических образцах и образцах изотипа позволяет оценить и сопоставить качество и эффективность всех наборов праймеров в диапазоне концентраций, обнаруженных в образцах. Перейдите в редактор подмножеств и отметьте подмножества, включая скважины с входными образцами, а также неизвестные образцы чипов. Неизвестные пробы будут количественно определены с помощью стандартной кривой, построенной на основе известных концентраций исходных проб для анализа.

После завершения амплификации ПЦР проведите анализ с помощью квантовой шкалы ABS. Вторая производная макс. Выберите поднабор для анализа и нажмите кнопку. Хорошо.

Нажмите calculate, который сгенерирует стандартную кривую с использованием известных концентраций входных образцов и отобразит абсолютное количество ДНК, присутствующей в неизвестных образцах, если качество ДНК хорошее и если праймеры специфически связываются с целевой областью, эффективность ПЦР должна быть близка к двум. Выполните анализ кривой плавления с вызовом TM для того же поднабора, если он доступен. Один пик указывает на то, что был усилен только один конкретный продукт.

Амплификация специфической ДНК также может быть проверена с помощью электро ПЦР-продукта вместе с лестницей ДНК через гель AROS. Полученные данные затем экспортируются в виде текстового файла, разделенного табуляцией, который можно открыть в Microsoft Excel для дальнейшего анализа. Разделите количество ДНК для конкретного антитела с контролем изотипа для таргетных праймеров.

Повторите этот шаг для контрольной области Primers. Если для разных иммунопреципитаций используется несколько антител одного и того же изотипа, нормализуйте каждое из них значениями из одного и того же изотипа контроля. Более того, если используется несколько пар целевых праймеров, то для нормализации каждой мишени следует использовать количество ДНК из одного контрольного набора для репарации праймеров.

Выходные значения представляют собой кратное обогащение иммунопреципитации специфических антител в каждой локализации относительно неспецифических антител Фоновая иммунопреципитация делит кратное обогащение для целевых праймеров с кратным обогащением для праймеров контрольной области для получения обогащения относительно контрольной несвязанной области. Важно отметить, что из-за построения стандартных кривых с общим количеством входной ДНК для каждого образца каждое из значений иммунопреципитации, интерполированных из стандарта, уже нормализовано и выражено в виде доли от общего количества входных данных программным обеспечением машины. Показанный здесь протокол иммунопреципитации хроматина контролирует различия, если таковые имеются, в количестве ДНК, используемой в ПЦР, с помощью пары праймеров, которая амплифицирует несвязанную область генома, тем самым выступая в качестве контроля нагрузки.

В этом примере кодирующая область мышиного гена бета-актина была использована в качестве области, не связанной с интересующим белком, а фактор транскрипции и сайт связывания жира на мыши, промотор IL 2 был использован в качестве целевой области. На этом снимке таблицы Excel показано использование протокола вычислений, описанного в данных анализа трех экспериментальных повторов в полях, окрашенных в желтый, зеленый и фиолетовый цвета, с тремя техническими повторами. Каждый из них использовался для расчета кратного обогащения.

Относительное обогащение белка, связанного с различными областями генома, можно сравнить, если выбран один и тот же набор контроля изотипа и специфических антител. Если специфичность антитела хорошая, обычно наблюдается обогащение от 2 до 10 раз по несвязанной контрольной области. На этом рисунке показаны результаты эксперимента с чипом с обычными CD четырьмя Т-клетками и регуляторными CD четырьмя Т-клетками, выделенными у мышей.

Небольшая часть обычных Т-клеток стимулировалась PMA и ионным мицином в течение 30 минут. Наблюдалось относительное обогащение факторов транскрипции NFA, N fat C one и NFA C 2 в промоторе IL two и показано здесь как кратное обогащение по несвязанной области После этой процедуры. Другие методы, такие как ChIP-seq, могут быть использованы для решения проблемы глобальной занятости факторов транскрипции или глобальных изменений эпигенетических меток в ответ на стимул.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как проводить иммунопреципитацию хроматина с использованием ограниченного числа клеток, а также анализировать данные QPCI для определения полосы транскрипционного фактора по сравнению с контрольной несвязанной областью.