Визуализация Caenorhabditis Elegans Кутикулы структур с помощью липофильных Vital краска, DII

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации кутикулы в прозрачной живой морской элегантности с помощью красного флуоресцентного липофильного красителя глаза. Это достигается путем подготовки популяции нематод к окрашиванию. Затем в популяцию добавляют разведенный краситель и дают им инкубироваться.

Затем животных извлекают из окрашивающего раствора. Флуоресцентная визуализация окрашенной кутикулы Дай показывает детали на поверхности, включая репродуктивные структуры глаз Эйли и Энн и другие внешние морфологические особенности. Основное преимущество этой методики перед существующими методами визуализации кутикулы в этом прозрачном организме, такими как прямая визуализация, флуоресценция, экспрессия трансгенов, окрашивание антителами, электронная микроскопия и меченый агглютинин зародышей пшеницы, заключается в том, что этот метод легко выполнить относительно быстро и недорого, а также дает прекрасное разрешение кутикулярных структур у живых животных.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы во многих областях, использующих модельную систему морской элегантности и ее кутикулу, таких как секреция клеток и организация кутикулы, развитие эпидермальных клеток, гетерохронические пути генов, врожденный иммунитет, развитие морфологических признаков и эволюция нематод. Демонстрировать процедуру будет Робби Шульц, аспирант из моей лаборатории. При работе с D Eye учитывайте, что он светочувствительный.

Всегда защищайте D-глаз от света, завернув его в фольгу. Также наденьте перчатки и лабораторный халат, так как DMF токсичен, а DAI — это автомобиль. Цианид Дай очень мощный.

Стандартное рабочее разведение составляет 30 микрограммов на миллилитр DII в М-9, а для одной популяции требуется всего 400 микролитров рабочего разведения. Начните с 60-миллиметровой плиты, населенной незараженными нематодами. Вымойте животных из тарелки по 1,5 миллилитра 0,5%-ным Тритоном Х 100.

В буфере М девять аккуратно взболтайте жидкость круговыми движениями, чтобы разрыхлить всех личинок и взрослых животных, а затем переложите промывку в 1,5-миллилитровую трубку. Немедленно убавьте животных при 2000 рекомендованной розничной цене М в течение 30 секунд, чтобы собрать животных на дне трубки. Выбросьте как можно больше надосадочной жидкости, не беспокоя животных.

Будьте осторожны, не жадничайте. Вымойте животных одним миллилитром М девяти. Открутите вниз и удалите надосадочную жидкость.

Повторите стирку. Снова открутите вниз и удалите надосадочную жидкость. Далее по 400 микролитров по 30 микрограмм на миллилитр Dai in M девять в трубку.

Кратковременно сделайте вихрь трубкой, чтобы снова подвешивать животных. Затем встряхните трубку при температуре 20 градусов Цельсия в горизонтальном положении в течение от трех до 16 часов при 350 оборотах М в защищенном от света месте. Время выполнения этих последних нескольких шагов имеет важное значение.

Во-первых, Triton X необходимо смыть, прежде чем он удалит липиды, которые связывает dai. Во-вторых, животных необходимо окрашивать в растворе красителя для глаз достаточно долго, чтобы кутикула могла равномерно окрашиваться. Чуть позже животным следует дать возможность восстановиться на пище достаточно долго, чтобы удалить несвязанный глаз.

По окончании окрашивания закрутите зверьков вниз и удалите раствор красителя. Вымойте животных одним миллилитром М девяти. Чтобы удалить несвязанный краситель, поверните животных вниз и удалите надосадочную жидкость.

Повторно суспензируйте животных в 400 микролитрах буфера M nine и вылейте их на свободную от бактерий часть микропланшета NGM. Посев OP 50 E Coli позволяет животным восстанавливаться в темноте не менее 30 минут, но не дольше суток, потому что флуоресценция красителя ослабевает во время восстановления. Животные должны отползать от окрашивающей жидкости на корм.

Этих животных легче визуализировать, так как они имеют меньшую фоновую флуоресценцию от глаза со свободным красителем. Начните с подготовки сельскохозяйственной подушки на горке, чтобы обеспечить равномерную толщину используемой сельскохозяйственной подушки. Две проставки.

Распорка изготавливается путем наложения двух кусков лабораторного скотча на предметное стекло. Проставки можно использовать бесконечно. Далее расположите чистое стеклянное предметное стекло вдоль между двумя дистанционными стеклами, пипеткой влейте около 150 микролитров расплавленного четырех агаров.

На центр чистого стекла задвижкой. Быстро накройте расплавленный AER дополнительным салазкой, расположенной перпендикулярно AER и обеим прокладкам, чтобы сформировать агаровую прокладку. Осторожно сдвиньте защитную заслонку, удерживая прокладку по центру верхней части монтажной заслонки.

Теперь пипеткой нанесите пять микролитров анестетика нематоды на подушечку, установите от восьми до 12 животных в анестетик и аккуратно накройте крышкой микроскопа. Наблюдайте за животными с помощью составного или конфокального микроскопа, оснащенного объективом не менее 40 раз и фильтром Трисси или другим совместимым фильтром. Максимум возбуждения флуоресценции глаза красителя составляет 549 нм, а максимум излучения – 565 нм.

Для связанного штампа визуализация является наиболее сложной частью этого протокола. Мы покажем, как монтировать животных для визуализации, но вы должны быть должным образом обучены работе с составным или конфокальным эндоскопом, который вы будете использовать. Мы обнаружили, что использование объектива с увеличением не менее 60 раз лучше всего подходит для разрешения деталей, освещенных методом окрашивания.

Каждое из изображений в этом разделе было сделано с использованием объектива с 63-кратным увеличением в элегантности плакатного эмбриона печати. Поверхность кутикулы содержит ежегодно разделенные окружными бороздами и на отдельных этапах продольные гребни, называемые айли. Каждое из изображений в этом разделе было сделано с объективом 63 раза в постэмбриональной элегантности C.

Поверхность кутикулы содержит годовые, разделенные окружными бороздами и на отдельных этапах продольные гребни, называемые алеями. Каждая стадия развития имеет структуру кутикулы с различными составами и узорами, гребнями или бороздами как aley, так и Aly Fluorescently окрашивания. В зависимости от состава поверхности.

На всех личиночных и взрослых стадиях при использовании этого метода стояния красителя они остаются видимыми в течение суток после восстановления. Фоновые флуоресцентные пятна иногда наблюдаются, но не регулярно. Это кутикула взрослых мутантных животных с умеренными дефектами организации кутикулы.

Гребни Эйли бывают прерывистыми и избыточными. Гребни Эйли сросшиеся и разветвленные или раздвоенные, общий трансгенный маркер. Доминантный аллель roll six вызывает скручивание кутикулы, которое можно увидеть в области волос и может привести к тому, что кольца будут иметь неравномерный рисунок.

Дай также окрашивает другие внешние структуры кутикулы, включая взрослого гермафродита, вульву и взрослого самца, поднятие хвоста, а веер дай также может выделить тонкие дефекты внешней морфологии, такие как этот раздвоенный хвост, недостаточное окрашивание. Например, двухчасовое окрашивание приводит к неоднородному окрашиванию кутикуляра, хотя нейроны, подверженные воздействию окружающей среды, могут окрашиваться После освоения этой техники ее можно сделать за четыре часа, не считая визуализации, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как окрашивать морскую элегантность с помощью глазка для наблюдения за кутикулой и другими внешними морфологическими структурами.