$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Начните с капли буферного раствора на предметном стекле микроскопа и перенесите неповрежденных червей в каплю. Как только черви окажутся на месте, используйте безворсовую ткань, чтобы впитать и удалить буфер. Закрепите образец, несколько раз промыв образцы 90% этанолом, давая ему испариться после каждого нанесения.
После того как этанол испарится после окончательной промывки, добавьте в образец раствор, содержащий краситель нуклеиновой кислоты DAPI. DAPI связывается преимущественно с адениновыми и тиминовыми основаниями в малой борозде ДНК. При связывании комплекс DAPI-DNA поглощает ультрафиолетовый свет и излучает видимый синий свет.
Затем добавьте консервант против выцветания, чтобы продлить срок хранения образца. Наклейте защитный лист и приклейте его к слайду. Затем используйте флуоресцентный микроскоп с синим фильтром для визуализации телец DAPI, которые, в зависимости от клетки и ее циклического статуса, могут представлять собой отдельные хромосомы, сестринские пары хроматид или целые ядра. В этом эксперименте мы будем подсчитывать окрашенные DAPI пары сестринских хроматид в ооцитах, чтобы идентифицировать тетраплоидные штаммы Caenorhabditis elegans.
- Тетраплоидные штаммы имеют 12 пар хромосом, что можно проверить, подсчитав окрашенные DAPI тельца в неоплодотворенных ооцитах. Для этого капните от пяти до десяти микролитров буфера M9 на предметное стекло и перенесите в каплю от шести до 10 предполагаемых тетраплоидов. Под рассекающим микроскопом тщательно впитайте большую часть M9 в чистящую салфетку, не содержащую ворса.
Затем капните 10 микролитров 90% этанола на червей и наблюдайте, как этанол полностью испаряется. Как только испарение закончится, повторите процесс добавления этанола и наблюдайте, как он испаряется. Всего добавьте 10 микролитров в четыре применения. После того, как последняя капля испарится, добавьте шесть микролитров DAPI в количестве двух нанограмм на микролитр, или аналогичное пятно.
Для длительного хранения предметных стекол установите червячки в коммерчески доступное или самодельное средство защиты от выцветания. Затем добавьте покровный лист и заклейте края лаком для ногтей. После того, как лак для ногтей высохнет, слайды можно забивать. Используйте флуоресцентный микроскоп и 100-кратное увеличение.
Во-первых, найдите самую зрелую неоплодотворенную яйцеклетку, которая непосредственно прилегает к сперматетеке, и еще не попала ни в сперматеку, ни в матку. Тельца DAPI здесь, предположительно, представляют собой одиночные хромосомные пары. Затем сфокусируйтесь на ядре ооцита и используйте тонкий фокус микроскопа, чтобы медленно сканировать его сверху вниз, подсчитывая тела DAPI. Затем пересчитайте тела DAPI в том же ядре, переместив фокус снизу вверх.
Ооциты дикого типа имеют в среднем шесть телец DAPI. Наличие 12 тел DAPI указывает на то, что животные этого штамма являются либо частичными, либо полными тетраплоидами. Анализируйте не менее 10 животных на каждую линию. Часто пары хромосом находятся очень близко друг к другу или соприкасаются, поэтому количество тел DAPI часто меньше, чем фактическое число пар хромосом.