Мультиплексный одиночных молекул группы Протеолиз измерений с использованием магнитных пинцет

Общая цель этой процедуры заключается в изучении влияния механической нагрузки на протеолитическое расщепление отдельных белков высокопараллельным и экономически эффективным способом. В этой демонстрации исследуется расщепление коллагена матриксной металлопротеиназой номер один: на первом этапе коллагеновые триммеры прикрепляются к стеклянной крышке проточной ячейки, а затем к отдельным молекулам коллагена прикрепляются магнитные шарики микрометрового размера. Второй шаг заключается в установке проточной ячейки в магнитный пинцет и проверке того, что неспецифически прикрепленные шарики были удалены с поверхности защитного скольжения.

Далее протеаза добавляется в проточные ячейки. Заключительным этапом является определение скорости протеолиза путем мониторинга отслоения бусин в режиме реального времени. Измеряя скорость отслоения шариков при различных концентрациях и силах протеазы, можно получить стандартные зоологические кинетические параметры, используя незначительные количества субстрата и протеазы.

Кроме того, этот метод дает уникальную информацию о влиянии механической силы на скорость протеолиза и на структурные изменения в белке субстрата, которые сопровождают расщепление. Основное преимущество этого метода по сравнению с другими методами, такими как оптические Т-следы и атомно-силовая микроскопия, заключается в том, что этот метод отличается высокой пропускной способностью и экономичностью. Хотя этот метод может дать представление об эффективной силе, действующей на протеолитическое расщепление отдельных белков, инструменты и методы могут быть применены к широкому кругу биофизических проблем, включая влияние силы на сворачивание белка и подтверждение.

Подготовка проточной ячейки начинается с очистки защитных стекол с помощью ультразвуковой обработки. Добавьте крышки в небольшую стеклянную емкость, способную вместить их, которая помещается в атор. Наполните емкость изопропанолом и обработайте изопропанолом в ванне в течение 20 минут и промойте крышки большим количеством деионизированной воды.

Наполните емкость водой и обрабатывайте ультразвуком в течение 20 минут. После высыхания ультразвуком крышка скользит в потоке отфильтрованного воздуха, очищенного от пыли. Осматривайте защитные стекла и используйте только те, на которых нет разводов.

Осторожно подожгите чехлы в течение нескольких секунд, чтобы очистить их от оставшейся пыли и влаги, проходя по чехлу. Проскальзывает через газовое пламя, создаваемое горелкой Бунзена, стараясь не деформировать защитное стекло из-за избыточного нагрева. На этом этапе удаляются остаточные поверхностные загрязнения.

Затем с помощью двустороннего скотча прикрепите два покровных слипа вместе. Предварительно разрезав ленту примерно три сантиметра в длину и 0,3 сантиметра в ширину, прикрепите ленту к покровному листу размером 22 на 40 миллиметров, оставив посередине канал размером 1,6 сантиметра. С помощью наконечника пипетки аккуратно надавите на крышку, чтобы убедиться, что лента правильно приклеена.

Магнитный пинцет был сконструирован этой лабораторией с использованием алюминиевого L-образного кронштейна с отверстием диаметром один миллиметр и установлен на вертикальном Z-трансляторе для модуляции высоты пинцета. Два постоянных редкоземельных магнита были прикреплены к кронштейну по обе стороны от отверстия для создания градиента магнитного поля. Правильная калибровка магнитной ловушки имеет важное значение для этой процедуры.

Чтобы обеспечить успех, мы используем два различных метода, описанных в этом разделе. Для калибровки магнитной ловушки используют предварительно подготовленную ДНК из фага Лямбда, меченного на его пяти простых и трех простых концах биотином и doxygen, как описано в письменном протоколе. Чтобы сначала прикрепить ДНК к проточной ячейке, заполните проточную ячейку раствором кислорода и антител против D и дайте антителу прилипнуть к стеклянной поверхности в течение 15 минут.

Затем съедают поверхность проточной ячейки для предотвращения неспецифического слипания ДНК путем добавления раствора BSA в проточную ячейку. Обратите внимание, что для этого этапа и всех последующих этапов объем реагента, добавляемого в проточную ячейку, должен быть не менее чем в два раза. Объем проточной ячейки, который в данной демонстрации составляет 75 микролитров, инкубируют проточную ячейку при комнатной температуре в течение 45 минут.

Повторив этот шаг, добавьте 50 пикомоляров функционализированной лямбда-ДНК и дайте ему прикрепиться к покровному листу в течение 15 минут, смойте излишки ДНК одним XPBS. Наконец, добавьте суперпарамагнитные шарики, покрытые стрептавидином, и дайте им прикрепиться к иммобилизованной ДНК в течение 15 минут. В этой демонстрации используются шарики размером 2,8 микрометра.

Смойте излишки шариков одним XPBS. Затем выполните калибровку магнитного пинцета, переместив постоянные магниты в положение, удаленное от поверхности образца. Затем поместите подготовленную проточную ячейку в микроскоп.

Переместите постоянные магниты в положение над проточной ячейкой. Выберите фокальную плоскость функционализированных шариков Lambda DNA, сфокусировавшись на бусинах вдали от обеих стеклянных поверхностей. Правильная фокальная плоскость – это та, в которой желаемые бусины имеют яркий центр.

Снимите видео движения бусин, которое на 80 герц больше в течение 500 кадров. Переместите магнит ближе к поверхности образца и запишите на видео движение шарика в каждом положении. Для расстояний более пяти миллиметров перемещайтесь с шагом в один миллиметр на расстояния от одного до пяти миллиметров.

Перемещение с шагом 0,5 мм на расстояния менее одного миллиметра, перемещение с шагом 0,25 мм Для каждого набора данных отслеживайте центр бусин с помощью 2D-гауссова аппроксимации. Расчет силы с помощью броуновских колебаний, как описано в письменной методике. Подтвердите точность сил, проверив расчет силы с помощью подгонки Lian по спектру мощности.

Для того, чтобы найти частоту спада, соотношение между приложенной силой и частотой спада можно найти в тексте до присоединения пептида коллагена к клеткам потока, экспрессии и очистки пептида коллагена и белков ММП-1. Начните с добавления раствора антитела против MIC в проточную ячейку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы позволить анти-мик прикрепиться к поверхности проточной ячейки, чтобы предотвратить неспецифическое прикрепление белков, используя пять миллиграммов на миллилитр. BSA Добавьте 150 пикомолярного пептида коллагена и дайте ему прикрепиться к антителу через метку M в течение 45 минут.

Смойте излишки коллагена с помощью буфера PBS перед добавлением шариков размером 2,8 микрометра в ячейку потока. Их следует отделить от стрептококка и покрытого шариками раствора с помощью сильных магнитов, а затем повторно суспендировать в PBS. Этот процесс следует повторить три раза.

Этот шаг необходим для того, чтобы шарики размером 2,8 микрометра связывались с поверхностным иммобилизованным пептидом коллагена. Затем добавьте суперпарамагнитные шарики, покрытые стрептококком дигидином стрептавидином и дайте им прикрепиться к молекулам коллагена в течение 45 минут. После того, как проточная ячейка будет собрана с помощью пептида коллагена и магнитных шариков, визуализируйте проточную ячейку в магнитной ловушке.

При малой силе субпопуляция бусин иногда бывает слабой, прилипающей к поверхности неспецифическим образом. Применение умеренной силы гарантирует, что эти бусины будут освобождены. Добавьте активированный фермент в проточную ячейку.

В этом случае MMP 1 предварительно активировали добавлением 3,5 миллимоляра А PMA и инкубировали при 37 градусах Цельсия в течение трех часов. Как только проточная ячейка будет снова введена в магнитный пинцет, запишите видео, охватывающее несколько полей зрения, обычно получая несколько сотен прикрепленных шариков. Это измерение соответствует времени, равному нулю.

Повторите тот же процесс записи нескольких полей зрения в определенные моменты времени до тех пор, пока все бусины не отсоединятся или не станет заметным дальнейший протеолиз. Магнитный пинцет был откалиброван на бусины размером один микрометр и 2,8 микрометра. Используя как величину наблюдаемых броуновских флуктуаций, так и расчет частоты спада при изменении положения магнитов в экспериментах по принудительному протеолизу, нормализованное количество оставшихся шариков может быть построено в зависимости от времени для нахождения скорости протеолиза.

И этот процесс можно повторять для различных концентраций и сил ферментов. Скорость протеолиза зависит от приложенной силы. Скорости протеолиза определяли при 6,2 пико-ньютонах и 13 пико-ньютонах.

Доля бусин лежит на отметке более 15 минут, остается примерно постоянной на уровне 0,25 в разных экспериментах. В нашем случае анализ позволил измерить каталитическую эффективность MMP one в зависимости от приложенного усилия. Проанализировав данные, мы обнаружили, что тройная спираль коллагена должна локально раскручиваться перед протеолизом.

После освоения этой техники ее можно выполнить за пять-шесть часов, если все сделать правильно. Важно помнить, что для получения хорошей статистической значимости ваших данных требуется не менее 30-50 бусин на одно топливо просмотра. Не забывайте, что PMA может быть чрезвычайно опасным, и при проведении этого эксперимента всегда следует использовать такие меры предосторожности, как перчатки, лабораторные халаты и маска для лица.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерить влияние силы на протеолитическое расщепление одиночных белков с помощью магнитного пинцета. Магнитный пинцет является отличным инструментом для понимания биофизических экспериментов с одной молекулой. Этот метод может быть распространен на другие комбинации протеазы и субстрата.

Кроме того, подобные методы могут быть использованы для понимания структурной динамики белка, а также для понимания других белков, которые связывают или модифицируют РНК и/или ДНК.