Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения для визуализации экзоцитарных событий

Начните с чашки со стеклянным дном, содержащей эмбриональные корковые нейроны на предметном столике для флуоресценции полного внутреннего отражения или микроскопа TIRF.

Эти нейроны экспрессируют pH-чувствительный зеленый флуоресцентный белок или маркер везикул, помеченный GFP, который флуоресцирует при нейтральном внеклеточном pH, но остается нефлуоресцентным в кислых везикулах.

При слиянии везикул с плазматической мембраной воздействие внеклеточного pH индуцирует флуоресценцию, отмечая событие экзоцитоза.

Выберите объектив и установите показатель преломления в соответствии с нейроном.

Направьте лазерный луч под углом к стеклу, что вызовет полное внутреннее отражение и создаст затухающую волну. Эта волна избирательно возбуждает маркеры GFP вблизи плазматической мембраны.

Установите глубину проникновения TIRF, чтобы исключить маркеры GFP над затухающим полем.

Во-первых, используйте широкопольное эпифлуоресцентное освещение для определения местоположения нейронов, экспрессирующих GFP.

Затем переключитесь на подсветку TIRF для специфического мембранного возбуждения.

Получение покадровых изображений для записи события слияния везикул и визуализации экзоцитоза.

После настройки микроскопа TIRF и