Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения для визуализации экзоцитарных событий

Начните с чашки со стеклянным дном, содержащей эмбриональные корковые нейроны на предметном столике для флуоресценции полного внутреннего отражения или микроскопа TIRF.

Эти нейроны экспрессируют pH-чувствительный зеленый флуоресцентный белок или маркер везикул, помеченный GFP, который флуоресцирует при нейтральном внеклеточном pH, но остается нефлуоресцентным в кислых везикулах.

При слиянии везикул с плазматической мембраной воздействие внеклеточного pH индуцирует флуоресценцию, отмечая событие экзоцитоза.

Выберите объектив и установите показатель преломления в соответствии с нейроном.

Направьте лазерный луч под углом к стеклу, что вызовет полное внутреннее отражение и создаст затухающую волну. Эта волна избирательно возбуждает маркеры GFP вблизи плазматической мембраны.

Установите глубину проникновения TIRF, чтобы исключить маркеры GFP над затухающим полем.

Во-первых, используйте широкопольное эпифлуоресцентное освещение для определения местоположения нейронов, экспрессирующих GFP.

Затем переключитесь на подсветку TIRF для специфического мембранного возбуждения.

Получение покадровых изображений для записи события слияния везикул и визуализации экзоцитоза.

После настройки микроскопа TIRF и образца и нахождения нейронной фокальной плоскости в соответствии с текстовым протоколом, запустите программное обеспечение лазера и подключитесь к программному обеспечению для управления лазером. Установите освещение на широкое поле и выберите объектив. Затем установите показатель преломления образца и отрегулируйте интенсивность лазера, сняв галочку TTL для лазера 491.

Оптимизация параметров визуализации важна при визуализации неповрежденных экзоцитарных везикул на дне, чтобы избежать смещения фокуса и фототоксичности при получении изображений с высоким соотношением сигнал/шум, достаточным для анализа.

Установите ползунок в положение 100, а затем уменьшите его до значения от 20 до 40. Затем перепроверьте TTL. Далее снова сфокусируйтесь на образце в освещении проходящим светом.

Затем в программном обеспечении для обработки изображений выберите лазерную подсветку 491 и откройте затвор. Поместите конденсор вверх дном на оптическую скамью, чтобы не поцарапать объектив. Точно отрегулируйте фокусную точку лазера на потолке.

И со снятым конденсатором центрировать точку к центру диафрагмы замкнутого поля. Затем замените конденсатор. А в программном обеспечении TIRF установите глубину проникновения равной 110 нанометрам. Затем переключитесь с широкоугольного освещения на режим освещения TIRF для получения изображений.

Теперь, используя широкопольную эпифлуоресценцию, найдите клетки, экспрессирующие флорин VAMP2, через окуляры. Затем, чтобы уменьшить фотообесцвечивание и фототоксичность, отрегулируйте параметры изображения, чтобы максимизировать отношение сигнал/шум и динамический диапазон с минимальным временем экспозиции и интенсивностью лазера. Установите непрерывный автофокус на ячейку. Затем получите набор цейтраферных изображений, сбор которых происходит каждые 0,5 секунды в течение 5 минут.