Визуализация Одноместный молекулярных комплексов В Vivo Использование дополнительных флуоресцентной микроскопии

Здесь мы демонстрируем протокол проведения флуоресцентной микроскопии живых бактериальных клеток, позволяющий обнаруживать, отслеживать и количественно оценивать функциональные молекулярные комплексы. Этот протокол начинается с выращивания бактерий, которые производят белок, помеченный флуоресцентной молекулой красителя. Через четыре-шесть часов небольшой объем клеток извлекается из культуры и их жгутиковые нити усекаются сдвигом.

Стеклянная крышка внутри проточной ячейки имеет покрытие, позволяющее ячейкам прилипать к поверхности. Клетки вводятся в проточную ячейку и связываются с помощью геллярного стержня, который просматривается флуоресцентно с помощью лазерной возбуждающей микроскопии. Затем камера с высокой квантовой эффективностью записывает яркие светлые и флуоресцентные изображения помеченных молекулярных комплексов.

Здравствуйте, меня зовут Ян Дой, и я работаю с Марком Ли на кафедре биохимии в Оксфордском университете. Я Алекс Робертсон, работаю с Марком Ли на физическом факультете. Я Ник Де из лаборатории утечек, также работаю на физическом факультете.

Сегодня мы покажем вам процедуру визуализации одиночных молекулярных комплексов в живых бактериях с помощью передовой флуоресцентной микроскопии. Мы используем эту процедуру для изучения этого в функциональном состоянии. Мы также исследуем динамику естественной биологической машины в реальном времени и нанометрового объектива.

Итак, приступим. Для начала разморозьте 50 микролитров замороженных стеблей бактерий кишечной палочки. Они были генетически модифицированы.

Чтобы пометить белок молекулой флуоресцентного красителя, инокулируйте пять миллилитров питательной среды LB и выращивайте бактерии аэробно встряхивая в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующее утро возьмите 50 микролитров насыщенной культуры и подкультивируйте ее в минимальные М 63 Питательные среды глюкозы инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия в течение четырех-шести часов. Здесь используются два разных клеточных штамма.

Один из них экспрессирует транспортирующий электроны цитохром, слитый с GFP. Другой экспрессирует белок, участвующий в моторе бактериальных жгутиков. Слитые с GFP клетки могут быть либо собраны непосредственно из растущей субкультуры, если их следует рассматривать как иммобилизованные образцы, либо они могут быть срезаны для усечения бактериальных жгутиков, если они рассматриваются в привязанных условиях.

Чтобы удалить бактерии, поместите от одного до пяти миллилитров субкультуры в устройство, состоящее из двух стерильных шприцев с помощью стерильных труб. Чередуйте проталкивание в каждый шприц насоса, чтобы протолкнуть культуру через узкую трубку примерно от 50 до 100 раз в зависимости от степени полученного сдвига. Затем центрифугируйте культуру для гранулирования клеток, а затем повторно суспендируйте клетки в минимальной среде для удаления фрагментов жгутиков. Как только ячейки будут готовы, приготовьте очищенные БК семь стеклянных крышек, погрузив их в насыщенный раствор гидроксида калия и этанола на 20 минут.

Тщательно промойте в деионизированной воде и этаноле и дайте высохнуть на воздухе не менее чем на один час. Затем постройте простую проточную ячейку для размещения клеток в микроскопе. Для этого нарисуйте линии парафиновой смазки на предметном стекле микроскопа БК с семью стеклами, а затем создайте туннельный сэндвич, положив сверху один из очищенных защитных стекол.

Аккуратно надавите на землю щипцами. Это должно дать проточную ячейку объемом от пяти до 10 микролитров. Для наблюдения за иммобилизованными клетками заполните проточную ячейку путем инъекции 0,1%-ного раствора поли-ллизина и дайте ей инкубироваться при комнатной температуре в течение не менее одной минуты.

Затем, промывая проточную ячейку путем введения 100 микролитров минимального количества среды с одного конца проточной ячейки и одновременно отводя среду через проточную ячейку с помощью папиросной бумаги с другого, WIC выбрасывает 20 микролитров латексных микросфер диаметром 200 нанометров диаметром 200 нанометров в минимальные среды, чтобы отметить поверхность скольжения покрова. Поместите проточную ячейку в простую камеру влажности и выдерживайте при комнатной температуре в течение пяти минут. Проточная ячейка перевернута таким образом, что крышка обращена вниз.

Затем непереплетенные бусины смываются путем впитывания через 100 микролитров минимального материала с помощью папиросной бумаги. Чтобы наблюдать за связанными клетками, пропустите этап инкубации поли-L-лизина, заполните проточную ячейку пятью микрограммами на миллилитр раствором гелланового антитела Anti-Flag, а затем поместите ее в камеру влажности на 10 минут. После инкубации промывайте проточную ячейку через фитиль папиросной бумагой.

Затем WIC 20 микролитров клеточной культуры пропускают через проточную ячейку с помощью папиросной бумаги, используя либо срезанный образец для наблюдения за привязанными клетками, либо неразделенный образец для просмотра иммобилизованных клеток, проточную ячейку переворачивают и помещают в камеру влажности на 20 минут. Затем несвязанные клетки вымываются путем впитывания через 100 микролитров минимальной среды. Капните каплю погружного масла в центр верхней поверхности покровного стекла.

Аккуратно поместите проточную ячейку на держатель образца специально изготовленного флуоресцентного микроскопа. Это должно обеспечить оптический контакт с объективом с высокой числовой апертурой. Затем включите камеру размножения электронов микроскопа и установите камеру на охлаждение до минус 70 градусов по Цельсию.

Программное обеспечение настроено на получение изображений с типичной частотой кадров 25 герц. В режиме передачи кадров. Включите светлопольную подсветку и сфокусируйте изображение.

Выберите подходящую ячейку или группу клеток для визуализации на основе того, что они застревают на своей длинной оси. Параллельно поверхности скольжения крышки отрегулируйте фокус, чтобы убедиться, что 200-нанометровые латексные бусины, прилипшие к поверхности скольжения крышки, находятся только в фокусе. Получите последовательность изображений в светлом поле, чтобы записать контур тела клетки.

После этого светлопольное освещение отключается, а усиление камеры включается на максимум для получения изображений с использованием флуоресценции полного внутреннего отражения, также известной как газон. Запустите захват камеры и откройте лазерный затвор, чтобы возбудить флуоресцентные белки внутри бактерий. Параметры интенсивности лазера и скорости сбора данных должны быть оптимизированы для конкретной биологической системы.

Исследуемые образцы подсвечиваются до фотообесцвечивания, что обычно занимает около 10 секунд. После того, как данные собраны, изображения подаются в специально написанную аналитическую программу, которая автоматически определяет положение флуоресцентных пятен в клетках с точностью до нескольких нанометров и извлекает их размер и яркость. Яркость следа фотообесцвечивания по отношению ко времени притяжения молекулярного комплекса затем используется для оценки использования стехиометрии.

При использовании этого метода изображение клеток, рассматриваемых в светлом поле, очень отчетливо, так что периметры тел клеток темные на фоне белого серого тела клеток, использующего флуоресценцию с иммобилизованными клетками. Отчетливые пятна интенсивности, как правило, от 250 до 300 нанометров в ширину, можно увидеть здесь в ложном цвете. Здоровые привязанные клетки можно увидеть, вращающиеся вокруг точки прикрепления троса на светлопольных изображениях под действием флуоресцентного возбуждения.

Некоторые молекулярные комплексы также могут быть видны в месте прикрепления, что указывает на локализацию бак-белка с мотором Геллера. Эти пятна представляют собой отдельные молекулярные комплексы. Количество таких комплексов будет зависеть от используемого режима освещения и от того, сколько комплексов фактически присутствует в клетке в любой момент времени.

Если плотность пятен изначально очень высока, как в случае с мечеными цитохромами, используемыми здесь, то выполнение начального отбеливания frap может улучшить контраст изображения. Подвижность пятен зависит от конкретной биологической системы. Мы только что показали вам, как визуализировать одиночные молекулярные комплексы с помощью передовой флуоресцентной микроскопии.

При выполнении этой процедуры важно не иметь срезных ячеек, так как это может нарушить функциональность флажкового мотора. Также важно не оставлять клетки на предметных стеклах микроскопа более чем на час, так как они могут обедниться кислородом. Для поиска наилучших условий визуализации требуется автоматизация.

Использование только очищенного GFP может помочь определить правильную мощность лазера для вашей конкретной системы микроскопа. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.