Визуализация Одноместный молекулярных комплексов В Vivo Использование дополнительных флуоресцентной микроскопии

В данной работе мы представляем протокол проведения флуоресцентной микроскопии одиночных молекул на живых бактериальных клетках для обнаружения, отслеживания и количественного анализа функциональных молекулярных комплексов. Протокол начинается с выращивания бактерий, экспрессирующих белок, меченный молекулой флуоресцентного красителя. Спустя четыре-шесть часов небольшой объем клеток извлекают из культуры, после чего нити их жгутиков укорачивают путем сдвигового воздействия.

Стеклянное покровное стекло внутри проточной кюветы подвергается нанесению покрытия для обеспечения адгезии клеток к поверхности. Клетки вводятся в проточную кювету и закрепляются с помощью гелларового стержня, который визуализируется методом флуоресценции с использованием лазерной возбуждающей микроскопии. Затем камера с высоким квантовым выходом регистрирует четкие изображения меченых молекулярных комплексов в светлом поле и в режиме флуоресценции.

Здравствуйте, меня зовут Ян Дой, я работаю с Марком Ли на кафедре биохимии Оксфордского университета. Я — Алекс Робертсон, работаю с Марком Ли на физическом факультете. Я — Ник Де из лаборатории Лика, которая также находится на физическом факультете.

Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру визуализации единичных молекулярных комплексов в живых бактериях с помощью передовой флуоресцентной микроскопии. Мы используем эту процедуру для изучения объектов в функциональном состоянии. Мы также применяем данный метод для исследования динамики природных биологических машин в реальном времени на нанометровом масштабе.

Итак, приступим. Для начала разморозьте 50 µL замороженных культур бактерий E. coli. Эти бактерии были генетически модифицированы.

Для мечения белка молекулой флуоресцентного красителя инокулируют пять миллилитров питательной среды LB и выращивают бактерии в аэробных условиях при перемешивании в течение ночи при 37 °C. На следующее утро берут 50 µL насыщенной культуры и переносятся в минимальную глюкозную среду M 63, которую инкубируют при 30 °C от четырех до шести часов. В данном случае используются два различных штамма клеток.

В одном случае экспрессируется переносящий электроны цитохром, слитый с GFP. В другом — белок, участвующий в работе бактериального жгутикового мотора. Клетки с GFP-слитым белком можно либо собрать непосредственно из растущей субкультуры, если их планируется рассматривать как иммобилизованные образцы, либо подвергнуть сдвигу для укорочения бактериальных жгутиков, если их планируется изучать в условиях прикрепления (tethered conditions).

Для деагрегации бактерий перенесите от одного до пяти миллилитров субкультуры в устройство, состоящее из двух стерильных шприцев, соединенных стерильной трубкой. Поочередно нажимайте на поршни шприцев, чтобы прогнать культуру через узкую трубку примерно 50–100 раз, в зависимости от требуемой степени деагрегации. Затем центрифугируйте культуру для осаждения клеток, после чего ресуспендируйте клетки в минимальной среде для удаления фрагментов жгутиков. Когда клетки будут готовы, подготовьте чистые предметные стекла BK 7, погрузив их в насыщенный раствор гидроксида калия и этанола на 20 минут.

Тщательно промойте деионизированной водой и этанолом, затем оставьте высыхать на воздухе минимум на один час. Далее сконструируйте простую проточную ячейку для размещения клеток в микроскопе. Для этого нанесите линии из парафинового жира на предметное стекло микроскопа из стекла BK7, а затем создайте структуру в виде «туннельного сэндвича», накрыв ее одним из очищенных покровных стекол.

Осторожно прижмите пинцетом. В результате объем проточной кюветы должен составить от 5 до 10 µL. Для наблюдения за иммобилизованными клетками заполните проточную кювету, введя 0,1% раствор поли-L-лизина, и оставьте для инкубации при комнатной температуре минимум на одну минуту.

Затем промойте проточную кювету, введя 100 µL минимальной среды с одного конца кюветы и одновременно удаляя среду из другого конца с помощью бумажной салфетки. После этого введите 20 µL разведения латексных микросфер диаметром 200 нм в минимальной среде (1:500) для маркировки поверхности покровного стекла. Поместите проточную кювету в простую увлажняющую камеру и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Переверните проточную кювету так, чтобы покровное стекло было направлено вниз.

Несвязанные бусины затем вымывают, пропитывая бумажной салфеткой 100 µL минимальной среды. Чтобы наблюдать за прикрепленными клетками, пропустите этап инкубации с поли-L-лизином; вместо этого заполните проточную ячейку раствором антител Anti-Flag в концентрации 5 µg/mL и поместите её в увлажнителе на 10 минут. После инкубации промойте проточную ячейку, пропитывая её бумажной салфеткой.

Затем с помощью фильтровальной бумаги впитайте 20 µL клеточной культуры через проточную кювету: используйте либо сдвигаемый образец для наблюдения за прикрепленными клетками, либо несдвигаемый образец для наблюдения за иммобилизованными клетками; затем переверните проточную кювету и поместите ее в увлажняющую камеру на 20 минут. После этого удалите несвязавшиеся клетки, промокав 100 µL минимальной среды. Нанесите каплю иммерсионного масла в центр верхней поверхности покровного стекла.

Осторожно поместите проточную кювету на держатель образца специально сконструированного флуоресцентного микроскопа. Кювета должна плотно прилегать к объективу с высокой числовой апертурой. Затем включите камеру с электронным умножением микроскопа и установите температуру охлаждения камеры на -70 °C.

Программное обеспечение настроено на захват изображений с типичной частотой кадров 25 hertz в режиме переноса кадров. Включите освещение в светлом поле и сфокусируйте изображение.

Выберите подходящую клетку или группу клеток для визуализации, основываясь на том, что они прикреплены своей длинной осью. Параллельно поверхности покровного стекла отрегулируйте фокус так, чтобы латексные сферы размером 200 nanometer, прикрепившиеся к поверхности покровного стекла, находились точно в фокусе. Получите серию изображений в режиме светлого поля, чтобы зафиксировать контуры тела клетки.

Затем выключается освещение в светлом поле и усиление камеры устанавливается на максимум для получения изображений с помощью флуоресценции полного внутреннего отражения, также известной как TIRF. Запустите захват изображения камерой и откройте затвор лазера, чтобы возбудить флуоресцентные белки внутри бактерий. Параметры интенсивности лазера и скорости захвата должны быть оптимизированы для конкретной биологической системы.

Исследуемые образцы освещают до полного фотообесцвечивания, что обычно занимает около 10 секунд. После сбора данных изображения подаются в специально написанную программу анализа, которая автоматически определяет положение флуоресцентных пятен в клетках с точностью до нескольких нанометров и вычисляет их размер и яркость. Зависимость яркости кривой фотообесцвечивания от времени затем используется для оценки стехиометрии привлекаемого молекулярного комплекса.

При использовании этого метода изображение клеток, наблюдаемых в светлом поле, получается очень четким, так как при использовании флуоресценции иммобилизованных клеток контуры тел клеток выглядят темными на фоне бело-серых тел клеток. Здесь в ложных цветах видны отчетливые пятна интенсивности, ширина которых обычно составляет от 250 до 300 нанометров. На изображениях в светлом поле при флуоресцентном возбуждении видно, как здоровые прикрепленные клетки вращаются вокруг точки прикрепления.

В точке прикрепления также могут наблюдаться отдельные молекулярные комплексы, что указывает на локализацию меченого белка с мотором Geller. Эти пятна представляют собой отдельные молекулярные комплексы. Количество видимых комплексов будет зависеть от используемого режима освещения и от того, сколько таких комплексов фактически присутствует в клетке в данный момент времени.

Если плотность пятен изначально очень высока, как в случае с мечеными цитохромами, используемыми в данной работе, то предварительное выжигание методом FRAP может улучшить контрастность изображения. Подвижность пятен зависит от конкретной биологической системы. В ходе исследования мы продемонстрировали способ визуализации единичных молекулярных комплексов с помощью современных методов флуоресцентной микроскопии.

При выполнении данной процедуры важно избегать повреждения клеток сдвигом, так как это может нарушить функциональность жгутикового мотора. Также важно не оставлять клетки на предметных стеклах более чем на один час, поскольку в них может истощиться запас кислорода. Для поиска оптимальных условий визуализации требуется автоматизация.

Для определения подходящей мощности лазера для вашей конкретной системы микроскопии может быть полезно использовать только очищенный GFP. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.