Визуальное описание вскрытия головного сосудистой поверхности и связанного с мозговых оболочек и сосудистых сплетений из мозга крысы

Общая цель этой процедуры заключается в эффективном и быстром рассечении кожуры и паутинной части мозговых оболочек и связанной с ними артериальной сосудистой системы, покрывающей поверхность коры и среднего мозга переднего и среднего мозга, таламуса и каллусов, а также в заборе сосудистого сплетения из боковых желудочков. Это достигается путем удаления шишковидной железы и отделения мозговых оболочек и артериальных желез, примыкающих к переднему мозгу. Во-вторых, артерии и артерии на поверхности коры головного мозга осторожно удаляются, начиная с вентрального круга Виллиса, а затем переходя к дорсальным поверхностям коры головного мозга, чтобы кожура и оставшиеся паутинные оболочки оставались прикрепленными к сосудистой сети, сводя к минимуму сбор прилегающих тканей поверхности коры.

Затем кора и комиссуральные волокна рассекаются от перегородки и гиппокампа, обнажая боковые желудочки, чтобы обеспечить сбор сосудистого сплетения. Наконец, гиппокамп удаляется, обнажая таламус и каллусы среднего мозга. Затем мозговые оболочки и связанная с ними сосудистая сеть, покрывающие эту область, рассекаются.

В конечном счете, целостность и специфичность рассеченных мозговых оболочек и связанной с ними артериальной сосудистой системы, а также сосудистого сплетения могут быть определены путем сравнения профилей экспрессии генов каждой из этих областей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в исследованиях, связанных с сосудами, поддерживающими функцию мозга. Он включает в себя сходства, сравнения и различия в функции сосудистого сплетения по сравнению с мозговыми оболочками и связанной с ним артериальной сосудистой сетью в отношении кровотока, функции спинномозговой жидкости, нейротоксических повреждений и травм головного мозга.

Чтобы начать этот протокол, поместите мозги, только что удаленные у крыс сразу после того, как они были усыплены, в ледяной холодный физиологический раствор на пять минут. Важно дать мозгу остыть в течение этого периода времени перед вскрытием, чтобы четыре мозговых оболочки и связанная с ними артериальная сосудистая сеть или MAV могли быть отделены от поверхности коры. Затем поместите мозг на дно стеклянной чашки Петри, лежащей на льду с одним сантиметром льда, холода, нормального физиологического раствора или 0,1 молярного фосфата натрия с буферизацией при pH 7,4.

Все вскрытия следует делать с мозгом, в основном погруженным в физиологический раствор. Чтобы начать диссекцию, поместите спинную сторону мозга вверх в чашку Петри и найдите шишковидную железу, которая находится в самой извилистой вентральной области между двумя полушариями. Только ростраль до мозжечка и чуть ниже, или у поверхности мозговых оболочек.

Над колли. Удалите шишковидную железу с помощью двух небольших щипцов с изогнутым кончиком. Обратите внимание, что шишковидная железа имеет розовый цвет, как и кора, но часто окружена остатками остаточной крови и сосудистой сети после удаления мозга.

Затем переверните мозг вверх ногами в чашке Петри. Затем отделите позвоночную артерию и более мелкие артерии и мозговые оболочки, покрывающие мост, от мозговых оболочек и сосудистой сети переднего мозга. Далее приступаем к удалению MAV.

Важно начинать вентрально в процессе диссекции с крупных артерий виллизилового круга, средних мозговых артерий и передних артерий. Затем, начиная с обоих полушарий, используйте небольшие щипцы с изогнутым кончиком, чтобы перерезать заднюю сообщающуюся артерию прямо позади внутреннего сонного соединения, тем самым разделяя более передние и задние артериальные деревья переднего мозга. Затем повторите тот же процесс для контралатерального полушария.

Теперь, захватив MCA и переднюю артерию щипцами, осторожно потяните в переднем дорсальном направлении, чтобы MAV, покрывающая вентральную переднюю кору, поднималась над обонятельным трактом и вокруг него. Это удаляет большую часть MAV, покрывающего переднюю кору головного мозга. Поверните мозг под углом от 45 до 90 градусов к чашке Петри так, чтобы боковые более передние области MAV, окружающие латеральные корковые области, могли быть освобождены от коры, захватите MCA и связанные с ней артерии и осторожно потяните дорсально вдоль коры.

При необходимости концы щипцов могут быть использованы для поднятия и освобождения крупных артерий от коры головного мозга во время диссекции. Теперь удалите более задние боковые области MAV. Обратите внимание, что лучше всего переключаться с одного полушария на другое во время этого процесса сбора, чтобы убедиться, что MAV остается холодным и увлажненным, а также переключать полушария, если возникает какое-либо сопротивление в освобождении MAV от коры.

Наконец, чтобы удалить наиболее дорсальные области MAV, окружающие первичную соматосенсорную и моторную кору, поверните мозг дорсальной стороной вверх, чтобы освободить этот участок от мозга, используйте концы щипцов вдоль сагиттального синуса. Эта часть собранного MAV может быть либо временно сохранена в ледяном солевом растворе до тех пор, пока она не понадобится для тестирования и анализа, либо заморожена для последующей обработки. Часто MAV, охватывающая самые задние области коры головного мозга, остается прикрепленной.

Его удаление показано в следующем разделе этого видео. Чтобы удалить сосудистое сплетение в первом положении, мозг должен быть расположен дорсальной стороной вверх и удерживать его на месте с помощью более крупных щипцов. Затем протолкните меньшие щипцы вниз через среднюю линию между полушариями и используйте концы, чтобы проколоть кору и мозолистое тело в верхней части средней линии гиппокампа.

Затем с помощью щипцов оттяните кору с мозолью от дорсального гиппокампа и перегородки, обнажив большую часть бокового желудочка. Сосудистое сплетение может быть расположено и идентифицировано по волнистой красной линии, обозначающей основную артерию, проходящую по его длине. С помощью двух концов щипцов подденьте боковые стенки третьего желудочка и увеличьте его на самом зубчатом конце.

Затем с помощью небольших щипцов освободите этот конец сосудистого сплетения. Затем с помощью щипцов увеличьте самую переднюю область между перегородкой и хвостатой областью путамена и освободите сосудистое сплетение на этом конце. Также проделайте ту же процедуру на контралатеральном полушарии для получения второго оставшегося сосудистого сплетения.

Опять же, эту ткань можно либо временно хранить во льду, холоде, физрастворе, либо замораживать для последующей обработки. Чтобы удалить оставшуюся МАВ, покрывающую самые задние участки коры, сначала удалите весь гиппокамп из обоих полушарий, обнажив МАВ над таламусом и колликулами. Обратите внимание, что удаление этой части MAV будет гораздо менее сложным, чем ее удаление из коры головного мозга для оставшейся MAV.

Захватывая более крупную сосудистую сеть, расположенную над передней частью таламуса, и осторожно потягивая ее, эта сосудистая сеть подключается к внешкольной сети Supra и снабжает кровью дорсальный гиппокамп и дорсальную сеть таламуса. Потяните подальше, и в конце концов надгорная сеть освободится, и тогда можно будет достичь последних участков артериального круга. На этом этапе необходимо уделить больше внимания удалению любых оставшихся MAV на поверхности зернистой линейной первичной, слуховой и зрительной коры.

Любые оставшиеся задние вентральные корковые MAV, собранные с помощью этого второго таламического и каллусного MAV, должны быть удалены и добавлены к первому расчлененному корковому участку MAV, если они должны быть проанализированы отдельно. Затем, чтобы сравнить профили экспрессии генов между теменной корой полосатого тела и областями MAV в контрольных условиях, анализ экспрессии генов может быть выполнен с использованием полного генома крысы Agilent 0 1 4 8 7 9, четыре на 44 060 мерных олигонуклеотидных массивов. Более подробную информацию об обработке, сканировании и первичном хранении данных можно найти в работе Thomas et al.

Когда вскрытие выполнено правильно. Полученные ткани MAV должны быть в двух неповрежденных объектах общим весом от 35 до 45 миллиграммов. Первоначально рассеченная МАВ, окружающая большую часть коры, должна весить около 25 миллиграммов, а покрывающая таламус, каллусы и затылочную кору должна весить около 15 миллиграммов.

Ткани должны быть слегка розоватого цвета от остаточной крови в сосудистой сети. Собранное двустороннее сосудистое сплетение должно быть в двух неповрежденных образцах ткани, каждый из которых весит от одного до двух миллиграммов, как показано на рисунке. Здесь мы видим сравнение профилей экспрессии генов в полосатой теменной коре и MAV в контрольных условиях.

На верхнем графике показана экспрессия в полосатом теле по сравнению с теменной корой. В то время как нижний график показывает экспрессию в MAV по сравнению с теменной корой, можно видеть, что полосатое тело и теменная кора гораздо более тесно связаны друг с другом, чем MAV. Здесь мы видим дифференциальную экспрессию генов в MAV в ответ на гипертермию по сравнению с контролем, в ответ на амфетамин по сравнению с контролем и при гипертермии по сравнению с амфетамином.

Наконец, здесь мы видим гены с более чем 15-кратной экспрессией в MAV по сравнению с теменной корой и стриатумом, характеризующиеся функцией. Многие из этих генов связаны с сосудистой и/или иммунной системой. Другими генами с очень большими изменениями кратности являются белки внеклеточного матрикса, соте транспортеры и метаболизм липидов и ретиноевой кислоты.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о терпении во время препарирования MAV. Также важно, чтобы мозг оставался погруженным в изотонический раствор или фосфатно-солевой буфер в течение всего вскрытия. Кроме того, рекомендуется отрабатывать разрез МАВ на четырех или пяти крысах до получения тканей для получения экспериментальных данных.