РНК-след Анализ Transcriptomes в тромбин обращению и контролю человека легочной микрососудистой эндотелиальных клеток

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы представить полный и подробный процесс применения RNA-Seq, мощной технологии секвенирования ДНК нового поколения, для профилирования транскриптомов. Это достигается путем выделения общей РНК из эндотелиальных клеток легких человека с лечением тромбином или без него и проверки качества РНК. Второй шаг — создание библиотек ДНК из этих образцов РНК.

Оптимизируйте генерацию кластеров с помощью инструмента cbot и выполните задачу секвенирования ДНК на HighSeq 1000. Затем проводится анализ данных для окончательной идентификации и отображения дифференциально экспрессируемых транскриптов генов. Последним шагом является валидация результатов RN AEQ с помощью RT, TP, CR. Основное преимущество IC по сравнению с существующими методами, такими как микрочип ДНК для анализа транскриптома, заключается в том, что IC может профилировать полный транскриптом, предоставлять цифровой тип данных и не полагаться на какую-либо известную геномизацию экспрессии генов в клетках.

В то время как измерение уровня МРА является полезным инструментом для определения того, как внешние сигналы влияют на транскрипцию клеточного механизма или как клетки различаются между состоянием здоровья и состоянием болезни. В этом протоколе мы продемонстрируем IC-анализ транскриптомов в обработанных тробином и контрольных легочных микрососудистых индо-син клетках человека. Этот протокол основан на нашем недавнем опубликованном исследовании, в котором мы успешно провели первый полный транскриптомный анализ микрососудистых эндотелиальных клеток легких человека, обработанных тромбином, с использованием RNA-Seq на High SEQ 1000, популярной платформе для секвенирования ДНК нового поколения. Г-жа

Суман Шаха продемонстрирует секвенирование ДНК на приборе High SEQ 1000, а также валидационный эксперимент R-T-P-C-R. Используя систему VS SEVEN R-T-P-C-R, д-р Денова продемонстрирует лечение тромбином легочных, микрососудистых эндотелиальных клеток человека и выделение общей клеточной РНК. Г-жа Маргарет Гибсон продемонстрирует систему Experian для проверки качества РНК и библиотеки ДНК, а также генерации кластеров на cbot.

А доктор Дмитрий Грегор продемонстрирует анализ данных для начала этой протокольной культуры. Микрососудистые эндотелиальные клетки легких человека до 90-100% конфлюенции в шести луночных планшетах в двух средах EGM с 5% факторами роста FBS и антибиотиками. Смените среду на среду для голодания за 30 минут до лечения тромбином.

Через 30 минут обработайте клетки 0,05 единицами на миллилитр, тромбином или оставьте без лечения в качестве контроля. Инкубируйте клетки в течение шести часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. После шестичасового лечения.

Выделите общую РНК из обработанных и контрольных клеток с помощью набора Nirvana в соответствии с инструкциями производителя. Оцените качество РНК с помощью стандартного эукариотического РНК-чипа Experian в соответствии со стандартным протоколом на автоматизированной станции электрофореза Experian. Наконец, количественно оцените РНК с помощью стандартного спектрофотометрического метода для построения библиотеки.

Используйте один микрограмм высококачественной общей РНК на образец в качестве исходного материала для создания библиотеки. Следуйте стандартному протоколу производителя. В этом протоколе проводятся два раунда отбора полигонов, содержащих мр.мРНК.

Чтобы удалить нашу РНК и свести к минимуму секвенирование РНК, оцените качество библиотек с помощью чипа Experian DNA one K. Согласно стандартному протоколу на автоматизированной станции электрофореза Experian. Количественная оценка библиотеки с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Сокращенно Q-R-T-P-C-R как описано в письменном протоколе. В сопровождении этого видео запустите Q-R-T-P-C-R в соответствии с протоколом cyber green MM и рассчитайте исходную концентрацию запасов в каждой библиотеке. Разбавьте библиотечные запасы до 10 наномоляров и храните при температуре 20 градусов Цельсия.

Когда проточная ячейка будет готова к кластеризации, разморозьте реагентную пластину cbot на водяной бане. CBOT — это инструмент, используемый для оптимизации процесса генерации кластеров. После промывки инструмента cbot денатурируйте библиотеки, сначала соединив 13 микролитров одного XTE и шесть микролитров 10 наномоляров.

Затем сбоку от каждой пробирки добавьте один микролитр одного нормального гидроксида натрия, закрутите трубки и инкубируйте его при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем поместите денатурированные библиотеки на лед. Затем разбавляют денатурированные библиотеки предварительно охлажденным гибридизационным буфером, смешивая 996 микролитров буфера и 4,0 микролитра денатурированной библиотеки для получения конечной концентрации 12 пикомоляров.

Поместите денатурированные разбавленные библиотеки. Затем переверните каждый ряд трубок пластины cbot, следя за тем, чтобы все реагенты размораживались. После вращения пластины снимите уплотнение фольги с ряда трубок гидроксида натрия и загрузите на аликвоту cbot.

120 микролитров разбавленных денатурированных библиотек в полосковую пробирку с маркировкой от одного до восьми. Добавьте 1,2 микролитра разбавленной денатурированной контрольной библиотеки PHI X в каждую пробирку в качестве пика контроля. После закручивания и вращения трубок загрузите их на кбот в правильной ориентации с трубкой номер один справа.

Загрузите проточную ячейку и коллектор на бот. Завершите проверку потока и начните выполнение кластеризации. После завершения прогона проверьте подачу реагентов по всем дорожкам.

Обратите внимание на любые отклонения от нормы. Либо немедленно запустите цикл секвенирования, либо храните проточную ячейку в прилагаемой пробирке при температуре четыре градуса Цельсия. Чтобы начать секвенирование.

Разморозьте секвенирование с помощью синтеза реагентов. Загрузите реагенты в соответствующие места на лотках с реагентами, стараясь не касаться других реагентов. После прикосновения к смеси для расщепления с помощью проточной ячейки без секвенирования линии реагентов дважды тщательно очистите проточную ячейку секвенирования 70% этанолом и салфетками Кима, а затем 70% этанолом и линзовой бумагой.

Осмотрите проточную ячейку на наличие разводов и при необходимости очистите ее. Загрузите проточную ячейку в секвенсор и выполните проверку потока, чтобы убедиться, что уплотнение между коллекторами и проточной ячейкой герметично. Запустите цикл секвенирования.

Оценивайте метрики качества по мере их появления во время пробежки Отслеживайте интенсивность на протяжении всего забега. После завершения 101 цикла. Выполните круговую химию, чтобы завершить второе чтение.

Первый отец парный и реагенты, а второй считывает инкорпорацию буфера. Затем загрузите реагенты, продолжайте секвенирование, запустите оценку. Во-вторых, считывайте интенсивность Q3 и другие показатели качества по мере выполнения забега.

Чтобы начать анализ данных, используйте последнюю версию маниоки для преобразования базовых файлов вызовов в файлы FAST Q. Установка числа быстрых кластеров Q равными нулю, чтобы обеспечить создание одного быстрого файла Q. Для каждого образца распакуйте быстрые Q-файлы для последующего анализа.

Выполняйте сопряжение и выравнивание с помощью последней версии Top Hat, которая выравнивает чтения RNA-Seq по размеру геномов млекопитающих с помощью инструментов Short Read со сверхвысокой пропускной способностью и SAM, в которых реализованы различные утилиты для выравнивания постобработки в формате SAM. Референсный транскриптом человека может быть загружен из I геномов в беговой шляпе были использованы все стандартные настройки параметров, включая вариант типа библиотеки в виде фрагмента незацепленного с использованием программы cuff diff части программного пакета cufflinks. Сравните клетки, обработанные тромбином, с контрольными клетками.

Отсейте дифференциально экспрессируемые транскрипты генов в клетках, обработанных тромбином, на основе референсного транскриптома человека. Затем используйте электронную таблицу для визуализации результата в виде таблицы. В этом случае были использованы все стандартные настройки параметров, и те транскрипты генов с FPKM менее 0,05 и p больше 0,05 были отфильтрованы для обнаружения новых изоформ без референса.

Сравните файлы транскриптома образца с референсным геномом с помощью cuff compare. Протестируйте дифференциальную экспрессию с помощью cuff diff, используя объединенные файлы трранскрипта тромбина в качестве референсного генома для одного анализа и объединенные файлы контрольных транскриптов в качестве референсного генома для второго анализа, опять же, используйте электронную таблицу для визуализации результата в табличном формате. Как и прежде, были отфильтрованы транскрипты генов с FPKM менее 0,05 и p больше 0,05.

После этого шага исследователи могут загрузить список недавно зарегистрированных транскриптов на веб-сайт браузера генома uc SC, чтобы проверить их достоверность с помощью ручной проверки. Списки дифференциально экспрессируемых генов также могут быть представлены для анализа путей ingenuity для характеристики генов и путей, затронутых лечением тромбином. На этом этапе исследователи могут выбрать cummerbund — пакет R, предназначенный для облегчения и упрощения задачи анализа вывода RN AEQ запонок для управления, визуализации и интеграции всех данных, полученных в результате дифференциального анализа манжеты.

Затем Q-R-T-P-C-R проводит валидацию результатов РН AEQ, сначала выполняет выделение общей РНК из контрольных и обработанных тромбином микрососудистых эндотелиальных клеток легких человека, оценку качества РНК и количественное определение РНК, как показано ранее в видео. Затем сгенерируйте комплементарную ДНК из одного микрограмма общей РНК каждого образца с помощью надстрочной системы синтеза трех первых цепочек rt в соответствии с инструкциями производителя. Наконец, проведите анализ Q-R-T-P-C-R на VI и семи системах ПЦР в реальном времени с использованием нуклеотидов, разработанных методом анализа TAC MAN по требованию, перечисленных в письменном протоколе, прилагаемом к этому видео, и измерьте количественную оценку, как описано там.

Соотношение 28 с к 18 S традиционно используется в качестве индикатора деградации РНК Чтобы более точно количественно оценить деградацию, система восприятия рассчитывает показатель качества РНК или число RQI. Алгоритм RQI сравнивает электроферограмму образцов РНК с данными из серии стандартизированных образцов деградированной РНК и автоматически возвращает число от 10 до одного. Образец РНК должен иметь RQI не менее семи, а в идеале больше восьми.

Эти результаты Experian указывают на высокое качество образца РНК с RQI 8,4. Библиотеки должны иметь широкополосную связь примерно от 250 до 300 пар оснований, как показано на этом рисунке результатов Experian для высококачественной библиотеки. Здесь показаны результаты Q-R-T-P-C-R стандартных образцов кривых и одного неизвестного образца.

Прогресс и качество выполнения секвенирования должны постоянно контролироваться на протяжении всего прогона. На этом рисунке показана соответствующая плотность кластера на первом этапе визуализации цикла. Это первый признак пробега.

Качественные кластеры должны быть яркими и сфокусированными. Показан пример первого базового отчета, созданного после завершения первого цикла. На этом этапе важно оценить предполагаемую плотность кластера, интенсивность и качество фокусировки.

Следующая контрольная точка качества после четвертого цикла показана здесь. Это показывает абсолютную плотность кластера для каждой полосы. Плотность кластера не должна быть выше 850 К на квадратный миллиметр после 13 цикла.

Рассчитываются характеристики фазирования и предварительного фазирования. Типичные числа находятся в диапазоне от 0,1 до 0,25. Основная оценка качества возможна после цикла 24, когда вычисляется несколько метрик качества.

Процент прочтений выше Q3 является мерой доверия к базе. Вызов чтения с оценкой Q, равной трем, означает, что вероятность того, что базовый вызов неправильный, составляет один из 1000. Оценка Q будет снижаться по мере выполнения прогона, но в начале должна быть более 95 % прочтений, соответствующих Q3 или превышающих Q3. Фильтр кластеров, проходящий через фильтр или pf, — это кластеры, из которых будут взяты фактические данные о последовательности.

В идеале он должен быть выше 85%Кластерный pf основан на многих факторах, включая фазирование, интенсивность предварительного фазирования, и Q3.It не будет меняться по ходу прогона. Процент выравнивания — это мера прочтений, которые совпадают в реальном времени с геномом FI x. Поскольку в библиотеки образцов было добавлено примерно 1% библиотеки FI x, процент выравнивания должен быть от 0,5 до единицы.

Эта статистика показывает, что содержимое библиотеки хорошо представлено кластерами и не было смещения генерации кластеров, перечисленных здесь экспрессированные гены и изоформы как в контрольных, так и в обработанных тромбином микрососудистых эндотелиальных клетках человека легких. Примечательно, что было обнаружено около 26 000 новых изоформ, которые иллюстрируют силу RN aeq. Он может идентифицировать неизвестные РНК.

В качестве альтернативы можно использовать сплайсированные транскрипты и альтернативные промоторы, которые не обнаруживаются с помощью микрочипов. RNA-Seq также может измерять менее распространенные транскрипты, которые неточно, количественно определены или не обнаружены микрочипами для проверки результатов RNA-Seq с использованием альтернативного подхода. Эксперимент A-Q-R-T-P-C-R был проведен для анализа трех различных генов в данных RNA-Seq: один из них был повышен в 7,96 раза.

Один из них был понижен в 1,16 раза, а два были понижены в 1,70 раза в данных Q-R-T-P-C-R, эти соответствующие цифры составляют плюс 7,25 раза минус 1,15 и минус 2,07 раза соответственно. Результаты этих трех генов, проанализированных с помощью RNA-Seq и Q-R-T-P-C-R, хорошо согласуются, что подтверждает результаты RNA-Seq. Этот протокол специфичен для IC в момент однократного лечения тробином легочных микрососудов человека в старших клетках, но он может быть легко адаптирован к многовременному исследованию или исследованиям в других клетках клеток, обработанных различными стимулами или ингибиторами, или сравнению транскриптомов в клетках или тканях между здоровым состоянием и состоянием заболевания.

Несмотря на то, что этот протокол специфичен для высокого SQ 1000, он применим к любому из семейства HighSeq или анализатору генома. Два прибора с незначительными изменениями этапов генерации кластеров и секвенирования реагентов. Другие платформы для секвенирования ДНК следующего поколения, такие как серия solid.

Системы GS, а также некоторые новые системы также используются для создания РНК-Seq. Несмотря на то, что их процедуры построения библиотеки и секвенирования могут немного отличаться, советы по работе с РНК, части анализа данных и валидация с помощью R-T-P-C-R, представленные в этом протоколе, могут иметь справочную ценность для их применения в области РНК-Seq.