Анализ профилирования тромба: платформа на основе микрофлюидики для всесторонней характеристики биомеханического тромбогенеза

Мы разработали новый метод, который позволяет адекватно фиксировать биомеханические характеристики тромбоза и обнаруживать протромботические аномалии у человека. Для начала используйте кремниевую пластину для изготовления главной формы с фоторезистом SU8 с помощью стандартной фотолитографии на основе дизайна и закрепите её на дне чашки Петри диаметром 15 сантиметров лентой. Приготовьте смесь полидиметилсилоксана, или PDMS, смешивая основание преполимера и отверждающее вещество из комплекта силиконового эластомера с соотношением веса 10 к 1.

Вылейте смесь PDMS на основную форму. Затем поместите пластину с PDMS-смесью в вакуумный десикатор для её дегазации. Термически отверждайте смесь PDMS, поместив её в инкубатор, установленный на 75 градусов Цельсия, на два часа.

После извлечения образца из инкубатора аккуратно вырезайте отверженный PDMS из основной формы и разделите отверждённые PDMS на отдельные блоки микросхем. Используя иглу зонда, проколите отверстия в указанных местах, чтобы создать вход и выход. В химической вытяжной жидкости используйте влажную салфетку с 75% этанола, чтобы очистить стеклянные стекли и высушить их.

Далее, используя генератор высокой частоты, обработайте стеклянные стекли в течение 30 секунд, а чипы PDMS — 20 секунд. Выровняйте каждый щеп стеклянным слайдом и аккуратно прижимайте щепу к поверхности стеклянного затвора, чтобы зацепить. Теперь термически соедините устройства, поместив их в духовку с температурой 150 градусов Цельсия на 15 минут.

После склеивания храните устройства при комнатной температуре в условиях без пыли. Затем, используя клещи, удалите пластиковую часть игл зонда и согните металлические трубки под углом 90 градусов, чтобы создать разъёмы для микрофлюидных устройств. После подготовки реакций на конъюгирование фибриногена и необходимости антител с Alexa Fluor центрифугуйте колонки для очистки при температуре 1 100 G на две минуты, чтобы удалить буфер для хранения.

После отброса потока загрузите реакционный раствор на колонку очистки, установленную в совместимом ампуле для сбора, и центрифугу при 1 100 G в течение пяти минут для получения необходимой смеси. С помощью спектрофотометра измеряйте поглощение белка и сигнала красителя. Вычислите концентрацию белка и молярное соотношение флуоресценции к белку.

Храните красители при четырёх градусах Цельсия в темноте. Добавьте гепарин в буфер Тирод до конечной концентрации 0,32 единицы на миллилитр на 10 миллилитров собранной крови и подготовьте шприц, аспирируя 500 микролитров буфера Тирод при pH 7,4. После сбора крови с помощью венипункции в шприце с гепарином переложите её в 15-миллилитровую центрифугную трубку и поддерживайте температуру 37 градусов Цельсия.

Разведите мономер фактора фон Виллебранда до двух микрограммов на миллилитр в PBS. Предварительное покрытие микрофлюидных приборов разбавленным мономером фактора фон Виллебранда и инкубировать их в течение часа при комнатной температуре. Теперь инкубировать образец крови с помощью люминесцентного датчика 1 или 2 на 10 минут при комнатной температуре.

Далее подключите микрофлюидное устройство с входными и выходными разъёмами и трубками. Подключите другой конец входного разъёма к трубке с PBS, а затем другой конец разъёма соедините с шприцом. Закрепите шприц на шприцовый насос, а микрофлюидное устройство — на перевёрнутый микроскоп.

Вручную управляйте ступенью микроскопа, чтобы определить место стеноза. Заполните микрофлюидный канал и трубку PBS с помощью шприцового насоса с расходом 0,5 миллилитра в минуту. Осмотрите устройство, чтобы убедиться, что вокруг места стеноза нет пузырьков воздуха.

Подключите впускную трубку к образцу крови и пропустите образец крови через микрофлюидный канал с помощью насоса шприца со скоростью потока 0,018 миллилитра в минуту. В инвертированном микроскопе установите время экспозиции и усиление для каждого флуоресцентного канала в программном обеспечении. Проведите многоцветную флуоресцентную визуализацию в реальном времени, чередуя четыре канала и возбуждая по одному флюоро-4 за раз.

Скорректируйте плоскость фокуса на тромбу и записывайте флуоресцентные сигналы в месте стеноза в течение 15–30 минут. Для анализа данных откройте файл с помощью ImageJ версии 1.53. Используйте канал SZ 22 fit C для определения контура тромба.

Затем, используя выбор полигонов, примерно выберите площадь тромба. Для каждого канала устраните фоновый сигнал, выбрав изображение, Adjust, а затем Threshold. Наконец, измерьте площадь и среднюю интенсивность сигнала внутри тромба, выбрав Analyze и Measure.

Репрезентативные снимки показали формирование тромби в здоровой крови в стенозном канале с тромбоцитами, фибриногеном, фактором фон Виллебранда и P-селектином, визуализированными с помощью сенсорного набора 1, а также тромбоцитов, фосфатидилсерин, E-положительный интегрин альфа IIb бета 3, активированный интегрин альфа IIb бета три, визуализированный с помощью сенсорного набора 2. Изображение одного флуоресцентного канала обрабатывалось путём выбора тромбовай области, удаления фонового сигнала и измерения площади сигнала и средней яркости для количественного анализа. Непрерывный анализ интенсивности флуоресцентного сигнала со временем создал кривую сигнала и времени для накопления тромбоцитов во время формирования тромба.

Для каждой временной точки были получены общие интенсивности сигнала для четырёх биомаркеров в первом наборе датчиков и четырёх биомаркеров во втором наборе. Был рассчитан размер тромба, и был сгенерирован семимерный профиль тромба. В настоящее время нет биоанализа для оценки протромботической тенденции у пациентов, и наша работа пытается заполнить этот пробел.

Обнаруживая биомеханическую активность образцов крови, наш анализ позволяет всесторонне оценить протромботические характеристики испытуемых. Наш анализ может быть превращён в клинический тест для выявления протромботической склонности у пациентов, а также для скрининга антитромботических препаратов следующего поколения.