Визуализация эндоплазматического ретикулума Локализованные мРНК в клетках млекопитающих

Целью этой процедуры является визуализация матричной РНК, которая связана с эндоплазматическим ретикулумом или er. Это достигается путем предварительного нанесения клеток культуры тканей млекопитающих на покровные листы. Вторым этапом процедуры является обработка клеток экстракционным буфером для удаления цитоплазматической мРНК, не связанной с er.

Следующими шагами являются быстрая фиксация клеток и окрашивание мРНК с помощью флуоресцентной гибридизации in situ. Заключительные шаги заключаются в том, чтобы получить изображение и затем количественно оценить количество флуоресценции, связанной с er. В конечном счете, результаты могут показать, как мРНК связаны с поверхностью этой органеллы в различных условиях.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы клеточной биологии, например, могут ли мРНК, кодирующие секреторные белки, сохраняться на поверхности ER, независимо от рибосом или синтеза белка. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку он включает в себя несколько сложных этапов клеточных манипуляций. Посев клеток тканевой культуры на обработанные кислотой покровные листы по крайней мере за один день до начала эксперимента стоят семь и из-за OS клетки являются подходящим выбором, поскольку они имеют высокую выработку секретируемого белка и хорошо определенные ЭР.

Если исследуется экзогенный Mr NA, трансфицируйте клетки через день после посева, а затем инкубируйте клетки еще в течение 18 часов, чтобы обеспечить MR. NA. В день проведения эксперимента. Для достижения высокой эффективности экстракции плавность клеток не должна превышать 80% CO на покровном листе, чтобы определить, взаимодействуют ли мРНК с ЭР независимо от того, можно ли обрабатывать клетки агентами, которые нарушают взаимодействие между рибосомами и мРНК у этих агентов или контролируют среду для клеток за 30 минут до экстракции.

В этом случае используются трансляционные ингибиторы, чистый Мицин и Homo Harrington in или HHT. Начните с нагревания свежеприготовленного экстракционного раствора, содержащего тонин и рабочий буфер в один XCHO до 37 градусов Цельсия. Установите нагревательный блок на 40 градусов Цельсия и вставьте перевернутый металлический блок, чтобы сформировать ровную рабочую поверхность.

Смочите металлический блок водой, затем наложите на него свежий кусок параформы и разгладьте любые пузырьки с помощью перчаток без РНК и безворсовых салфеток. Далее для каждой пары покровных листов подготовьте шестилуночную пластину для промывки и закрепления ячеек на четырех лунках. Добавьте два миллилитра подогретого буфера СНО в последние две лунки.

Добавьте два миллилитра раствора для фиксации. Затем храните тарелку при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока она не понадобится. На нагревательный блок поместите каплю в 100 микролитров раствора для экстракции на каждый покровный лист обрабатываемых клеток.

Теперь с помощью ювелирных щипцов возьмите покровный лист с ячеистым покрытием и опустите его в первую и вторую лунки, содержащие буфер CHO. При этом смывается питательная среда. Затем быстро снимите излишки буфера с обратной стороны защитного стекла.

И ненадолго положите защитную ячейку лицевой стороной вниз на раствор для экстракции. Через 10 секунд перенесите защитную ячейку стороной вверх в буфер фиксации, где она должна оставаться не менее 15 минут. Этап экстракции клеток необходим для удаления всей мРНК cyop plasticky, которая не связана с ER.

Кроме того, подготовьте контрольную крышку, в которой ячейки фиксируются без извлечения. Шаг после фиксации. Дважды промойте эти извлеченные unex контрольные клетки PBS, а затем запекайте PBS и TRITTON X 100.

Хотя это и не обязательно, вкапывание извлеченных клеток также следует промыть тем же раствором PBS и Triton для снижения фоновой флуоресценции после проникновения клеток. Дважды промойте слайды с помощью PBS, чтобы удалить фиксатор и моющее средство. Затем дважды промойте предметные стекла с 60% фиде в одноразовом буфере цитрата натрия или SSC.

Однако, если для окрашивания всех клеток используется олиго-зонд DT для окрашивания, поли-мРНК снижает уровень fide до 25%. Разведите пробник рыбного запаса до 0,2 микромоля в той же концентрации фиде в буфере для гибридизации. Теперь подготовьте камеру окрашивания.

Наполните дно 150-миллиметровой чашки Петри водой. Затем плаваем на воде кусочек параформы и переворачиваем блюдо вверх дном. Пара-пленка будет прилипать к дну посуды по мере выхода воды.

Если есть пузырьки воздуха, удалите их в перчатках и без ворса салфетками на каждую крышку нанесите 100 микролитров раствора гибридизации, содержащегося рыбьим щупом, на парапленку. Теперь положите защитную ячейку лицевой стороной вниз на раствор. Наконец, инкубируйте камеру от пяти до 24 часов в теплой увлажненной камере.

Прежде чем время окрашивания рыбы истечет, подготовьте зону для промывки, свободную от РНК, смочите ровную поверхность водой и покройте ее полосками парама. Удалите пузырьки воздуха в перчатках и салфетках. Когда окрашивание закончится, перенесите камеру в рабочую зону для каждой крышки прокладывайте пипеткой один миллилитр промывочного буфера на зону мойки.

Пара-пленка для переноса покровного стекла Сначала пипеткой внесите полмиллилитра рыбы в буфер возле края каждой крышки. Жидкость будет втягиваться под покровную крышку за счет капиллярного действия. Далее с помощью щипцов извлеките из камеры покровные листы и поместите их на капли промывочного буфера.

И подождите пять минут. Повторите эту технику стирки еще три раза. С помощью свежего одного миллилитра капли смывного буфера на зону мытья.

Тем временем очистите стекольные стекла 70% этанолом и высушите их безворсовыми салфетками. Затем для каждого покровного стекла нанесите 25 микролитров монтажного раствора DPI на предметное стекло С помощью щипцов возьмите покровное накладку и высушите его заднюю сторону безворсовой салфеткой, чтобы удалить излишки буфера для стирки. Затем перенесите защитную ячейку стороной вниз на каплю монтажного раствора.

Готовые слайды можно хранить при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока они не будут сфотографированы по стоимости. Семь клеток, которые были трансфицированы плазмидами, содержащими плацентарную щелочную фосфатазу или цитохром P 4 58 B, одну из них либо экстрагировали тонином, а затем фиксировали, либо напрямую фиксировали для определения процентного соотношения этих мРНК с ER. Неядерная флуоресценция была количественно определена в обоих образцах, и для обеих мРНК была рассчитана доля мРНК, ассоциированной с ER.

Около 60% цитоплазматической фракции было связано с ЭР для мониторинга ЭР-ассоциации этих транскриптов. После трансфицированной диссоциации рибосом семь клеток обрабатывали контрольными средами, pur MYCIN или HHT, а затем экстрагировали тонин и фиксированную мРНК. Окрашивание показало, что мРНК A LPP, но не CYP eight P one, оставалась связанной с ER после разрушения рибосом.

Количественное определение мРНК подтвердило это наблюдение и, что важно, показало, что уровень ядерной мРНК был одинаковым во всех образцах. Эти данные показывают, что подмножество целевых мРНК ER, таких как транскрипт A LPP, сохраняется на поверхности ER после разборки рибосом. Используя этот протокол, мы можем начать исследование того, как различные мРНК локализуются в различных субклеточных компартментах, таких как эндоплазматический ретикул, в сочетании с другими анализами, используемыми для анализа ядерного экспорта мРНК.

Эта процедура может быть использована для изучения первоначального нацеливания вновь синтезированных мРНК на поверхность er.