Микрофлюидных основе электротаксис по требованию Количественный анализ Caenorhabditis Элеганс 'Передвижение

Общая цель этой процедуры заключается в выявлении аномалий в нейрональной и нервно-мышечной передаче сигналов в модельном организме С. Аллергана после химического воздействия или генетических манипуляций. Для этого сначала разрабатывается и вытравливается микроканальный узор на кремниевой пластине. На втором этапе силиконовая форма используется для литья одного или нескольких микроканалов из PDMS.

Затем вспомогательные компоненты крепятся к пресс-форме PDMS. Затем поведение червей, когда их стимулируют проплыть через микроканал, записывается с помощью камеры, установленной под микроскопом. В конечном счете, электромикрофлюидика используется для определения изменений в нематоде, нейронной и мышечной системах из-за химических или генетических манипуляций с локомоцией в качестве считывания.

Таким образом, основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, особенно поведенческими анализами на основе планшетов, заключается в том, что с помощью этого метода можно строго контролировать направление движения червя, что позволяет точно количественно оценить поведение локомотива, такое как частота изгиба тела, время вращения и скорость плавания. Применение этого метода распространяется на терапию нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Паркинсона и Альцгеймера, поскольку он может быть использован для скрининга химических и генетических факторов с нейропротекторными свойствами. Впервые идея этой техники пришла нам в голову, когда мы поняли, что не хватает метода для количественного анализа поведения движения метода.

Движение является произвольным и случайным, и его трудно охарактеризовать. Поэтому мы хотели разработать простой метод, который может освоить каждый: чтобы сделать мастер-форму, начните с купания трехдюймовой силиконовой пластины в ацетоне, а затем в метаноле в течение 30 секунд каждая. Затем промойте деионизированной водой в течение пяти минут.

Затем с помощью азотного пистолета высушите поверхность пластины, а затем нагрейте пластину на горячей плите до 120 градусов Цельсия через две минуты, плазма окислит поверхность кремниевой пластины мощностью 50 Вт в течение одной минуты. Теперь с помощью трех миллилитров SU eight 100 фоторезиста отжимаем поверхность пластины при 1,750 об/мин в течение 40 секунд, а затем предварительно выпекаем покрытую пластину на горячей плите при температуре 65 градусов Цельсия. Через 10 минут увеличьте температуру до 95 градусов Цельсия в течение двух минут и выпекайте еще час.

Сняв пластину с конфорки, расположите над пластиной фотомаску нужного дизайна. Экспонируйте фоторезист под воздействием ультрафиолетового света в течение 95 секунд. Затем выпекайте на горячей плите, используя тот же температурный градиент, который использовался для предварительно выпеченных после выпечки.

Погрузите пластину в СУ восемь. Разработайте решение в течение 10-15 минут. Промойте пластину изопропанолом для подтверждения завершения разработки проекта.

Затем смойте деионизированной водой в течение 30 секунд. Наконец, высушите с помощью азотного пистолета и выпекайте при температуре 120 градусов Цельсия. Теперь поместите изготовленную мастер-форму, а также заготовку силиконовой пластины в две отдельные чашки Петри, выстланные алюминиевой фольгой.

Залейте 20 миллилитров предварительного полимера PDMS в форму и чашку и 15 миллилитров в пустую вафельную форму. Затем аккуратно надавите на одноразовым деревянным аппликатором, чтобы устранить любые воздушные карманы под вафлями, а затем накройте обе посуды и отложите их в сторону на день для затвердевания. После того как затвердеют, снимите фольгу и снимите PDMS.

Затем с помощью 2,5-миллиметрового единорога Harris пробивка отверстий доступа к жидкости на обоих концах канала в PDMS из мастер-формы. Разрежьте оба диска PDMS на полоски одинакового размера. Затем в чистом помещении загрузите канал, пустую полосу PDMS и предметное стекло вставьте в плазменный окислитель.

Подвергайте материалы воздействию кислородной плазмы мощностью 40 Вт в течение 40 секунд. Затем приклейте швеллер и предметное стекло к противоположным сторонам заготовки полосы и отложите материалы в сторону, чтобы завершить склеивание. Через два часа с помощью предварительного полимера PDMS прикрепите два куска пластиковой трубки длиной не менее шести дюймов к перфорированным резервуарам на горячей пластине при температуре 120 градусов Цельсия.

Дайте PDMS отверститься, прежде чем продолжить. Затем прикрепите к одной из трубок соединитель из жидкого пластика, чтобы можно было насадить шприц. Теперь вставьте трехдюймовый изолированный медный провод 22 калибра в каждый резервуар между входной трубкой и каналом, защищающим провода с большим количеством предварительного полимера PDMS.

Начните этот шаг с размещения только что собранного микроканала на подвижном предметном столике микроскопа XY с установленной камерой, подключенной к монитору, подключите блок питания к микроканалам электродов. Убедившись, что сопротивление микроканала составляет около 0,6 мегаом, присоедините выходную трубку микроканала к одноразовому шприцу. Затем погрузите устье входной трубки в раствор нематод, взвешенный в физиологическом буфере М девять.

Приложите отрицательное давление внутри шприца, чтобы отсосать жидкость в канал. Когда входная и выпускная трубки будут заполнены, отсоедините шприц и гидростатический заряд. Управляйте потоком, регулируя относительную высоту трубок, чтобы разместить червячка в центре канала.

Затем положите обе трубки плашмя на одной и той же высоте, чтобы поддерживать нулевой поток внутри микроканала. При переключении образцов червячков во время эксперимента с электротаксисом, после выравнивания обеих входных трубок на одной и той же высоте, если поток все еще присутствует, внесите небольшие корректировки высоты трубки относительно друг друга. Если мы когда-нибудь не будем уверены в том, что поток действительно равен нулю, мы можем вызвать обратное движение червя, изменив полярность электрического поля, а затем оценив линейную скорость червя при его вращении.

Теперь установите блок питания на соответствующее напряжение. Активируйте электрический сигнал и дайте червю одну минуту предварительного воздействия, чтобы он акклиматизировался к полю, в течение которой червь должен начать движение к катоду по прошествии минуты. Начните запись.

Когда эксперимент будет закончен, удалите всю жидкость и червей из канала. Промойте камеру деионизированной водой и оставьте устройство на горячей плите при температуре 125 градусов Цельсия для высыхания. В этом репрезентативном видео показана электроось молодой нематоды дикого типа, а также ее положение и скорость, полученные от программного обеспечения для отслеживания червей.

Видео начинается с катода справа. Внешний вид стеклянной пипетки свидетельствует о предстоящем развороте, последующем удалении сигналов пипетки. Момент разворота здесь, данные для зависимости положения от времени и мгновенной скорости от времени выходы пользовательской программы слежения за червем для червя На видео показана программа, рассчитанная кривая скорости от временной кривой положения.

На этой ящичковой диаграмме отображаются данные об электроскорости от набора диких типов и траншейных животных. Т-трансгенные животные экспрессируют ген альфа-синуклеина человека в мышцах стенок тела под контролем промотора гена тяжелой цепи миозина UNC 54, который вызывает агрегацию белков и проявляется в виде более медленной электротактической реакции, чем у животных дикого типа. После освоения более 20 червей можно анализировать каждый час, если эксперимент с электротаксисом выполнен правильно.

Пытаясь пройти эту процедуру, важно помнить, что только мутации и химические вещества, влияющие на локомоцию или чувствительность электроса, приведут к появлению фенотипов, которые можно обнаружить с помощью анализа электротакси. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как сделать узор на силиконе. Мы собрали микрофлюидный канал и научились анализировать локомоцию по методу N с помощью анализа axxis.