Микрофлюидных основе электротаксис по требованию Количественный анализ

Общая цель данной процедуры заключается в выявлении нарушений нейронной и нейромышечной передачи сигналов в модельном организме C Allergan после химического воздействия или генетической манипуляции. Для этого сначала разрабатывается и вытравливается рисунок микроканалов на кремниевой пластине. На втором этапе кремниевая форма используется для изготовления одного или нескольких микроканалов из PDMS.

Затем к форме из ПДМС присоединяют вспомогательные компоненты. Далее с помощью камеры, установленной на микроскопе, регистрируют поведение червей при их стимулировании к плаванию через микроканал. В конечном итоге электромикрофлюидика используется для определения изменений в нейронной и мышечной системах нематод вследствие химического или генетического воздействия, где в качестве измеряемого параметра выступает локомоция.

Таким образом, основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими, особенно с поведенческими тестами на чашках, является то, что с его помощью можно жестко контролировать направление движения червя, что позволяет точно количественно оценить такие параметры локомоторного поведения, как частота изгибов тела, время вращения и скорость плавания. Значение этого метода распространяется на терапию нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Паркинсона и Альцгеймера, поскольку он может быть использован для скрининга химических и генетических факторов с нейропротекторными свойствами. Идея этого метода возникла у нас, когда мы осознали отсутствие способа количественного анализа двигательного поведения.

Движения являются произвольными и случайными, что затрудняет их характеристику. Поэтому мы стремились разработать простой метод, доступный для освоения каждому. Для изготовления мастер-формы начните с погружения трехдюймовой кремниевой пластины в ацетон, а затем в метанол на 30 секунд в каждом растворе. После этого промывайте пластину деионизированной водой в течение пяти минут.

Затем с помощью азотного обдувочного пистолета высушите поверхность пластины, после чего нагрейте ее на плитке при 120 °C в течение двух минут, а затем проведите плазменное окисление поверхности кремниевой пластины при мощности 50 Вт в течение одной минуты. Теперь, используя 3 мл фоторезиста SU-8 100, нанесите его на поверхность пластины методом центрифугирования при 1 750 об/мин в течение 40 секунд, после чего проведите предварительный запек coated-пластины на плитке при 65 °C. Через 10 минут в течение двух минут увеличьте температуру до 95 °C и запекайте пластину еще один час.

После снятия подложки с нагревательной плитки расположите над ней фотошаблон с необходимым рисунком. Подвергните фоторезист воздействию УФ-излучения в течение 95 секунд. Затем проведите запекание подложки на нагревательной плитке, используя тот же температурный градиент, что и при предварительном запекании.

Погрузите пластину в SU-8. Выдержите в проявителе в течение 10–15 минут. Промойте пластину изопропанолом, чтобы подтвердить завершение проявления рисунка.

Затем промойте деионизированной водой в течение 30 секунд. В завершение высушите пластину с помощью азотного пистолета и подвергните кратковременному запеканию при 120 °C. Теперь поместите изготовленную мастер-форму, а также чистую кремниевую пластину в две отдельные чашки Петри, выстланные алюминиевой фольгой.

Налейте 20 миллилитров преполимера PDMS в мастер-форму и чашку, и 15 миллилитров в чашку с чистой подложкой. Затем осторожно нажмите на подложки одноразовым деревянным аппликатором, чтобы удалить любые воздушные пузырьки под ними, после чего накройте обе чашки и оставьте их на один день для отверждения. После отверждения подложек снимите фольгу и отделите PDMS.

Затем с помощью 2,5-миллиметрового пробойника Harris unicorn проделайте отверстия для доступа жидкости по обоим концам канала в PDMS, полученном из мастер-формы. Разрежьте оба диска из PDMS на полоски одинакового размера. После этого в чистом помещении поместите канал, пустую полоску PDMS и предметное стекло в установку для плазменного окисления.

Подвергните материалы воздействию кислородной плазмы при мощности 40 Вт в течение 40 секунд. Затем прикрепите деталь канала и стеклянное предметное стекло к противоположным сторонам заготовки и оставьте материалы для завершения процесса склеивания. Через два часа с помощью преполимера PDMS прикрепите два отрезка пластиковой трубки длиной не менее шести дюймов к пробитым резервуарам на нагревательном столе при температуре 120 °C.

Дайте ПДМС полимеризоваться перед продолжением работы. Затем прикрепите к одной из трубок пластиковый жидкостный коннектор для возможности подключения шприца. Теперь вставьте отрезки изолированного медного провода калибра 22 длиной три дюйма в каждый резервуар между входной трубкой и каналом, зафиксировав провода дополнительным преполимером ПДМС.

Начните этот этап с размещения только что собранного микроканала на подвижной платформе микроскопа с осями XY, оснащенного камерой, подключенной к монитору; подсоедините источник питания к электродам микроканала. Убедившись, что сопротивление микроканала составляет около 0.6 mega ohms, присоедините выходную трубку микроканала к одноразовому шприцу. Затем погрузите конец входной трубки в раствор нематод, суспендированных в физиологическом буфере M nine.

Создайте отрицательное давление внутри шприца, чтобы аспирировать жидкость в канал. Когда входная и выходная трубки будут заполнены, отсоедините шприц и гидростатический резервуар. Регулируйте поток, изменяя относительную высоту трубок, чтобы переместить червя в центр канала.

Затем расположите обе трубки горизонтально на одном уровне, чтобы обеспечить отсутствие потока внутри микроканала. При смене образцов червей в ходе эксперимента по электротаксису, после выравнивания обеих входных трубок, если поток все еще сохраняется, внесите небольшие коррективы в высоту трубок относительно друг друга. Если возникают сомнения в том, что поток действительно равен нулю, можно вызвать смену направления движения червя, изменив полярность электрического поля, а затем оценить линейную скорость червя в момент его разворота.

Теперь установите на источнике питания соответствующее напряжение. Подайте электрический сигнал и обеспечьте одну минуту предварительного воздействия, чтобы червь адаптировался к полю; по истечении этой минуты червь должен начать движение в сторону катода. Начните запись.

По завершении эксперимента удалите всю жидкость и нематод из канала. Промойте камеру деионизированной водой и оставьте устройство на плитке при температуре 125 °C для высушивания. В данном репрезентативном видео показана электроаксис молодых взрослых нематод дикого типа, а также выходные данные об их положении и скорости из программного обеспечения для трекинга червей.

Видео начинается с катода справа. Появление стеклянной пипетки указывает на предстоящую инверсию, а последующее извлечение пипетки служит сигналом. В момент инверсии здесь показаны данные зависимости положения от времени и мгновенной скорости от времени, выданные специализированной программой для трекинга червей для червя на видео; программа рассчитала кривую скорости на основе кривой зависимости положения от времени.

На данной диаграмме размаха представлены данные о скорости электротаксиса группы животных дикого типа и трансгенных животных. Т-трансгенные животные экспрессируют ген человеческого альфа-синуклеина в мышцах телостной стенки под контролем промотора гена тяжелой цепи миозина UNC 54, что вызывает агрегацию белка и проявляется в более медленном электротаксическом ответе по сравнению с животными дикого типа. При должном освоении методики и правильном проведении эксперимента по электротаксису можно тестировать более 20 червей в час.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что только мутации и химические вещества, влияющие на локомоцию или электрорецепцию, приведут к возникновению фенотипов, которые можно обнаружить с помощью анализа электротаксиса. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать формы из силикона, собирать микрофлюидные каналы и анализировать локомоцию N. methusala с помощью анализа электротаксиса.