Использование адаптированных Microfluidic обонятельных чип для отображения активности нейронов в ответ на феромоны в мужской C. Elegans головы нейронов

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы эффективно улавливать мимолетность кальция в нейронах головы самцов C.elegans при воздействии феромонов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как понимание регуляции нейронных цепей, специфичных для пола. Основное преимущество этой методики заключается в том, что самцы C.elegans теперь могут быть эффективно визуализированы с помощью микрофлюидного устройства ловушки.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что поначалу загрузка животных может быть затруднена, а биогенные феромоны не вызывают мимолетность кальция у каждого животного. Чтобы начать сборку резервуаров, подготовьте три комплекта трубок, вставив иглу в один конец и металлическую трубку в другой. Затем для каждого резервуара возьмите трехходовой люэровский клапан и прикрепите к нему 30-миллилитровый шприц со снятым поршнем, трехмиллилитровый шприц и трубку.

Заполните каждый резервуар подходящим буфером, либо стимулом S базальным, либо S базальным, содержащим флуоресцин. Затем удалите все пузырьки воздуха как из резервуара, так и из трубки, щелкая и прокачивая шприц. Теперь наполните новый трехмиллилитровый шприц и трубку базальным S и вставьте в выходное отверстие микрофлюидного устройства.

Аккуратно надавите на шприц до тех пор, пока буфер не появится на поверхности входных отверстий. Затем подсоедините трубки регулятора потока, буфера и резервуара стимула к соответствующим входным отверстиям, убедившись, что капли жидкости присутствуют как на загрузочном отверстии, так и на прикрепляемых трубках. Теперь осторожно надавите на шприц еще немного, пока на входе отверстия для загрузки червей не появятся капли, затем вставьте в этот порт твердый блокирующий штифт.

Далее извлеките шприц из выходного отверстия и подсоедините выходную линию, подключенную к дому вакуума. Теперь осмотрите прибор на наличие пузырьков в поплавковых каналах в видеопотоке с микроскопа. Нажмите на кнопку «В реальном времени», чтобы наблюдать за изображением в реальном времени, и подождите, пока пузырьки естественным образом рассеются, прежде чем продолжить.

Затем включите флуоресцентный источник света и используйте фильтр GFP для подтверждения правильной динамики потока. Приведите в действие трехволновой клапан и наблюдайте, как флуоресцентный управляющий поток появляется в видеопотоке, когда клапан открыт. Для начала возьмите одного червя на незасеянную пластину с агаром NGM и дайте червю уползти.

Затем поплавайте пластину с базалью S. Наберите раствор, содержащий червя, в шприц. Теперь на приборе отключите вакуум для остановки потока с помощью выпускного люэровского клапана.

Затем снимите твердый штифт, который блокирует отверстие для загрузки червяка. Вставьте трубку с червями в загрузочное отверстие. Откройте выпускной люэровский клапан и наблюдайте за видеопотоком в реальном времени.

Теперь слегка надавите на шприц до тех пор, пока не появится червь. Потяните червя назад, если он входит хвостом вперед, он должен войти головой вперед, чтобы подвергнуться раздражителю. Пользователь должен вытащить червя обратно до того, как хвост полностью войдет в канал, в противном случае извлечение червя из канала чрезвычайно затруднительно и обычно требует полной промывки червя через канал и загрузки нового червя.

Теперь, используя давление от шприца, протолкните червя через канал и расположите голову червя так, чтобы она подвергалась воздействию буферного потока, но не настолько глубоко в канал, чтобы она могла свободно перемещаться. У непарализованных животных ожидается небольшое осевое или вращательное движение. Хотя добавление паралитика в буферы практически нивелирует этот эффект.

Чтобы снизить вероятность движения во время испытания, используйте более старых самцов, которые более эффективно отлавливаются, уменьшите ширину или толщину отверстия для загрузки червей или увеличьте количество времени, проводимого в паралитике. Используйте программное обеспечение для записи с использованием возбуждения синим светом. Установите экспозицию на 100 миллисекунд, откройте окно получения изображения, установите временные точки на 300 с интервалом на нуле, затем начните получение изображения.

Через пять секунд примените стимул, изменив трехходовой клапан, контролирующий буферы. 10-секундная стимуляция является хорошей отправной точкой, и продолжительность стимуляции может быть скорректирована по мере необходимости. После стимуляции переключите поток обратно, снова нажав кнопку, и продолжайте запись до тех пор, пока не завершится 30-секундное видео.

Это позволяет флуоресценции g camp вернуться к исходной линии. Теперь дайте подготовке отдохнуть 30 секунд перед следующим испытанием. Черви, экспрессирующие g camp three в невосприимчивом нейроне, ASH, реагируют на один молярный глицерин видимыми изменениями флуоресценции в нейроне ASH, что указывает на нейронную активность.

Нейрон должен оставаться в зоне анализа на протяжении всего видео, иначе может произойти артефакт движения. Если это так, переместите область анализа для этих временных точек и объедините значения интенсивности, чтобы создать одну трассировку. У самцов, которые стимулировались привлекательным биогенным феромоном аскарозидом 3 во время воздействия, в четырех нейронах CEM измерялась транзиторность кальция.

От животного к животному и от нейрона к нейрону следы различались по форме, знаку и величине. Таким образом, очень важно анализировать многих животных при изучении феромонных реакций. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как загрузить самца C elegans в микрофлюидное устройство и проанализировать транзиторность кальция в нейронах головы.

Тот же процесс может быть использован с гермафродитами для выявления специфических различий в нейронных реакциях. После освоения этой техники ее можно сделать за полчаса для первого изображенного животного. После первой записи новое животное может быть загружено в изображение примерно за 10 минут.

После этой процедуры другие методы, такие как оптогенетика, могут быть объединены с этим протоколом, чтобы лучше понять, как регулируются нейронные цепи.