Транскриптомных анализ человеческой сетчатки Хирургические образцы Использование Журнала

Общая цель данной процедуры заключается в очистке РНК из хирургических образцов сетчатки человека для анализа транскриптома при отслойке сетчатки. Для этого в лаборатории подготавливаются реагенты и материалы, необходимые для сбора хирургического образца, которые затем отправляются в больницу. В ходе хирургической операции образец собирается и возвращается в лабораторию.

Затем РНК очищают с использованием стандартной процедуры градиента хлорида цезия и оценивают качество очищенной РНК. В конечном итоге анализ экспрессии мРНК показывает, что при отслойке сетчатки задействованы как воспаление, так и дегенерация фоторецепторов, о чем свидетельствуют изменения в экспрессии ключевых генов. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами очистки РНК, такими как использование хлороформа при экстракции (также известным как фенол-хлороформная экстракция), является то, что полученная РНК не содержит загрязнений ДНК в процессах, выявленных при транскриптомном анализе.

Применение этого метода распространяется на терапию отслойки сетчатки, так как он предоставляет технические средства для разработки новых вспомогательных методов лечения. Для каждого собираемого образца используйте свободную от РНКа пипетку, чтобы наполнить стерильную полиэтиленовую пробирку с кругным дном объемом пять миллилитров 2,4 миллилитра 6 M раствора гуанидинхлорида, свободного от РНКа. Используйте аргон для заполнения верхней части пробирок.

Затем быстро закройте крышку, плотно прижав её для обеспечения герметичности. Это предотвратит окисление хлорида гуанина в течение нескольких лет хранения в хирургическом шкафу. Далее поместите каждую пробирку объемом 5 мл в стерильную полипропиленовую коническую пробирку объемом 50 мл.

После добавления ткани и завинчивания крышки поместите пробирки объемом 50 milliliter в полистироловый штатив. Затем поместите штатив и подготовленные конверты вместе с заполненными формами для транспортировки в картонную коробку в больнице. Перенесите картонную коробку из хирургического шкафа в операционную.

Во время операции поместите образец сетчатки в пробирку, заполненную раствором хлорида в объеме quantity. Плотно закройте пробирку. Кратковременно перемешайте содержимое пробирки.

Затем поместите пробирку на рокер для перемешивания крови на 10 минут. Заполните прилагаемую форму образца, указав идентификационные данные пациента, дату операции и любые дополнительные примечания. Затем запишите идентификационный номер на соответствующую пронумерованную пробирку объемом 50 миллилитров.

Затем поместите пробирку объемом 5 мл с операционным материалом в пробирку объемом 50 мл. Добавьте бумажные салфетки и закройте пробирку крышкой. После этого поместите пробирку объемом 50 мл и форму приема образца в соответствующий мягкий конверт и запечатайте его.

После получения образца в лаборатории гомогенизируйте пробу в пробирке объемом пять миллилитров с помощью гомогенизатора Polytron™ на максимальной настройке в течение одной минуты, перемещая пробирку вверх и вниз. После гомогенизации образца для экстракции полисахаридов добавьте 270 µL 2 M ацетата калия и поместите пробирку на шейкер в горизонтальном положении. Интенсивно встряхивайте в течение 10 минут, затем центрифугируйте в течение 10 минут при 6 500 G и 20 °C.

После центрифугирования с помощью пипетки осторожно аспирируйте растворимую фракцию, не затрагивая осадок. Перенесите супернатант в стерильную пробирку объемом 14 мл, не содержащую РНКаз. К супернатанту добавьте 5,3 мл 1% раствора лаурилсаркозина в 100 мМ Трис и 3,2 г хлорида цезия.

Саркозин растворит мембрану, а хлорид цезия используется для создания градиента. Перемешайте содержимое пробирки с помощью вортекса в течение одной минуты. Добавьте 1,8 миллилитра раствора хлорида цезия и ЭДТА в стерильную полимерную центрифужную пробирку объемом 11 миллилитров.

Затем с помощью стерильной пипетки Пастера объемом 10 миллилитров осторожно наслоите раствор РНК на раствор хлорида цезия и ЭДТА, позволяя жидкости стекать по внутренней стенке пробирки. Поместите пробирки в центрифугу. При необходимости используйте вторую пробирку с буферами без ретины для балансировки; центрифугируйте в течение 24 часов при 225 000 G и 20 °C.

Следующий день. После центрифугирования в верхней части пробирки образуется липидный слой. ДНК будет находиться посередине, а РНК выпадет в осадок на дне пробирки.

С помощью стерильной пастеровской пипетки осторожно удалите верхний липидный слой, используя вторую стерильную пастеровскую пипетку. Постепенно удаляйте раствор, пока не будет аспирирована вязкая ДНК. Утилизируйте раствор и ДНК.

Затем с помощью третьей стерильной пастернажной пипетки удалите и утилизируйте оставшийся раствор, стараясь не повредить осадок РНК. Теперь, используя стерилизованный в пламени скальпель, разрежьте пробирку, как показано здесь, и удалите ее верхнюю часть.

Поместите оставшуюся часть вверх дном на стерильную марлю. Переверните пробирку и осторожно промойте ее с помощью пипетки 160 µL хлорида гуанидина. Дайте осадку высохнуть в течение 10 минут.

После высушивания осадка его ресуспендируют в 150 µL раствора Tris-EDTA-SDS. Затем добавляют 150 µL раствора Tris-EDTA и 30 µL 3 M ацетата натрия, после чего перемешивают на вортексе для осаждения РНК. Добавляют 900 µL ледяного 100% этанола.

Перемешайте содержимое пробирки на вортексе и поместите ее на тающий лед на 30 минут. Затем центрифугируйте пробирку в течение 30 минут при 18, 000 G и температуре четыре градуса Цельсия. После центрифугирования может быть виден или отсутствовать крошечный белый осадок.

Независимо от того, виден ли осадок, осторожно аспирируйте супернатант и удалите его. Затем, чтобы удалить избыток соли, добавьте 500 µL 70% этанола комнатной температуры и перемешайте на вортексе, после чего центрифугируйте пробирку в течение 20 минут при 18 000 G и температуре 4 °C. После повторной промывки 70% этанолом и центрифугирования используйте пипетку P 200, чтобы удалить остатки этанола.

Дайте осадку высохнуть на воздухе в течение 10 минут. Ресуспендируйте осадок в 50 µL деионизированной воды, интенсивно перемешивая на вортексе в течение двух минут. Затем поместите образец в водяную баню при температуре 45 °C на 15 минут.

Для полного ресуспендирования РНК. В завершение определите концентрацию РНК по абсорбции при 260 нанометрах и проанализируйте РНК с помощью гель-электрофореза согласно протоколу. В сопроводительном документе «Для исследования транскриптома отслойки сетчатки» была использована процедура, описанная в журнале, для выделения и анализа РНК сетчатки 18 пациентов с отслойкой сетчатки и 18 соответствующих по возрасту контрольных образцов, приготовленных из посмертных образцов сетчатки.

Затем РНК была очищена и проанализирована с помощью гель-электрофореза и ретиновой базы, как описано в данном отчете; здесь представлены лепестковые диаграммы, отображающие экспрессию гена моноцитарного хемотаксического фактора MCP-1 (CCL2). Правая часть рисунка с пометкой RD соответствует РНК пациентов с отслойкой сетчатки, а левая часть с пометкой N — РНК контрольной группы, как видно здесь. Отслойка сетчатки приводит к повышению экспрессии CCL2, о чем свидетельствуют высокие значения C в большинстве образцов RD справа по сравнению с контрольными образцами слева.

Это увеличение указывает на воспаление у пациентов с отслойкой сетчатки, что видно здесь. Экспрессия гена GNAT1, отвечающего за трансдукцию в палочковых фоторецепторах, была снижена, в отличие от CCL2; значения для образцов с RD справа низкие. Также наблюдалось снижение экспрессии коротковолнового опсина колбочек OPN1SW и гомеогенного гена CRX, что свидетельствует о дегенерации как палочек, так и колбочек у пациентов с отслойкой сетчатки. Данный метод позволяет получить представление об изменениях экспрессии генов после отслойки сетчатки. Он также может быть применен к другим патологиям сетчатки на моделях животных, таким как наследственные дистрофии сетчатки.

Лица, ранее не применявшие данный метод, могут столкнуться с трудностями, так как он требует знаний о нуклеиновых кислотах. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку работа с РНК после сертификации является сложной.