Транскриптомных анализ человеческой сетчатки Хирургические образцы Использование Журнала

Общая цель этой процедуры заключается в выделении РНК из хирургических образцов сетчатки человека для анализа транскриптома при отслойке сетчатки. С помощью журнала для этого в лаборатории подготавливаются реагенты и материалы, необходимые для сбора хирургического образца, и они отправляются в больницу. Во время хирургической процедуры образец собирается и возвращается в лабораторию.

Затем РНК очищают с помощью стандартизированной процедуры градиента хлорида цезия и оценивают качество очищенной РНК. В конце концов. Анализ экспрессии мРНК показывает, что как воспаление, так и дегенерация фоторецепторов участвуют в отслойке сетчатки, о чем свидетельствуют изменения в экспрессии ключевых генов. В этих процессах выявлено с помощью транскриптомного анализа, основное преимущество РНК по сравнению с существующими очистителями орн, такими как GTIN хлор от экстракции, также известный как оле, заключается в том, что в результате орны не загрязнены ДНК.

Применение этой техники распространяется и на терапию отслойки сетчатки, поскольку она предоставляет технические средства для разработки новых адъювантных терапий. Для каждого образца, который будет собран, используйте пипетку, свободную от РНК, чтобы заполнить стерильную полиэтиленовую пробирку с круглым дном объемом пять миллилитров 2,4 миллилитрами раствора хлорида гина без шести молярных РНК. Используйте газ аргон для заполнения верхней части трубок.

Затем быстро установите крышку, плотно прижав, чтобы убедиться, что она герметична. Это предотвратит окисление гвинея хлорида в течение нескольких лет хранения в хирургическом шкафу. Далее поместите каждую из пяти миллилитровых трубок в 50-миллилитровую стерильную полипропиленовую трубку с коническим дном.

Добавив салфетку и закрутив колпачок, поместите 50 миллилитровые пробирки в полистирольную решетку. Затем поместите стеллаж и подготовленные конверты вместе с подготовленными бланками отгрузки в картонную коробку в больнице. Принесите картонную коробку из хирургического шкафа в операционную.

Во время операции поместите образец сетчатки в пробирку, наполненную раствором хлорида. Плотно закройте трубку. Немного перемешайте тюбик.

Затем поместите трубку на качалку с пробиркой для крови на 10 минут. Заполните прилагаемый образец формы с указанием идентификации пациента, даты операции и любых дополнительных замечаний. Затем запишите идентификационный номер на соответствующую пронумерованную 50-миллилитровую трубку.

Затем поместите пятимиллилитровую трубку с хирургическим образцом в 50-миллилитровую трубку. Замените бумажную салфетку и закройте трубку крышкой. Затем поместите 50-миллилитровую пробирку и форму для забора образцов в соответствующий мягкий конверт и запечатайте его.

После того, как образец будет получен в лаборатории, гомогенизируйте образец в пятимиллилитровой пробирке с помощью гомогенизатора polytron TM на максимальной настройке в течение одной минуты, перемещая пробирку вверх и вниз. После того, как образец будет гомогенизирован, чтобы извлечь полисахариды, добавьте 270 микролитров двухмолярного ацетата калия и поместите пробирку на шейкер в горизонтальном положении. Энергично встряхивайте в течение 10 минут, затем центрифугируйте в течение 10 минут при температуре 6 500 G при 20 градусах Цельсия.

После отжима с помощью пипетки осторожно отсасывайте растворимую фракцию, не нарушая гранулу. Перенесите надосадочную жидкость в 14-миллилитровую стерильную пробирку со свободными РНК. Рядом с надосадочной жидкостью добавьте 5,3 миллилитра 1% и саркозина лавра в 100 миллимолярных три, а также 3,2 грамма хлорида цезия.

Саркозин растворяет мембрану, а хлорид цезия используется для создания градиента. Перемешивайте тюбик, вортексируя в течение одной минуты. Добавьте 1,8 миллилитра хлорида цезия ЭДТА в стерильную полимерную центрифужную пробирку объемом 11 миллилитров.

Затем с помощью стерильной пипетки пастор объемом 10 миллилитров нанесите раствор РНК на раствор хлорида цезия ЭДТА, позволив ему стекать по внутренней поверхности пробирки. Поместите пробирки в центрифугу. При необходимости используйте вторую пробирку, содержащую буферы без сетчатки, в качестве весов и вращайте в течение 24 часов при температуре 225 000 G при 20 градусах Цельсия.

На следующий день. После вращения в верхней части трубки образуется липидный слой. ДНК будет находиться в середине, а РНК будет гранулирована на дне пробирки.

С помощью стерильной пастеровой пипетки осторожно удалите и выбросьте верхний липидный слой с помощью второй стерильной пастериальной пипетки. Постепенно удаляйте раствор до тех пор, пока вязкая ДНК не будет аспирирована. Выбросьте раствор и ДНК.

Затем с помощью третьей стерильной пасторской пипетки извлеките и выбросьте оставшийся раствор. Будьте осторожны, чтобы не потревожить гранулу РНК. Теперь с помощью стерилизованного пламенем скальпеля разрежьте трубку, как показано здесь, и выбросьте верхнюю часть.

Оставшуюся часть положите вверх дном на стерильную марлю. Переверните трубку и с помощью пипетки аккуратно промойте ее 160 микролитрами гинового хлорида. Дайте грануле обсохнуть в течение 10 минут.

Как только пеллеты высохнут, ресуспендируют в 150 микролитрах триса, E-D-T-A-S-D-S. Далее добавьте 150 микролитров триса, ЭДТА и 30 микролитров трехмолярного ацетата натрия, а затем вихревыми для осаждения РНК. Добавьте 900 микролитров ледяного, 100% этанола.

Сделайте трубку вихревой и поместите ее на тающий лед на 30 минут. Затем центрифугируйте пробирку в течение 30 минут при температуре 18 000 G при четырех градусах Цельсия. После вращения крошечная белая гранула может быть видна, а может и не быть видна.

Независимо от того, видно ли гранулу, деликатно отсасывайте надосадочную жидкость и выбрасывайте ее. Затем для удаления излишков соли добавьте 500 микролитров комнатной температуры, 70% этанола и вихрь в трубку центрифуги, в пробирку на 20 минут при 18 000 G при четырех градусах Цельсия. После повторения промывки и отжима с использованием 70% этанола с помощью пипетки P 200 удалите остатки этанола.

Дайте гранулам высохнуть на воздухе в течение 10 минут. Повторно суспендируйте гранулу в 50 микролитрах обработанной воды, энергично перемешайте в течение двух минут. Затем поместите образец на водяную баню при температуре 45 градусов Цельсия на 15 минут.

Для полной суспензии РНК. Окончательно определите концентрацию РНК по абсорбции на 260 нанометрах и проанализируйте РНК методом гель-электрофореза в соответствии с протоколом. В сопроводительном документе «Для изучения транскриптома отслойки сетчатки» была использована процедура журнала для восстановления и анализа РНК сетчатки у 18 пациентов с отслойкой сетчатки и 18 контрольных групп соответствующего возраста, подготовленных с использованием посмертной сетчатки.

Впоследствии РНК очищали и анализировали с помощью гель-электрофореза и основания реттино, как описано в этом отчете, здесь представлены радарные графики, представляющие экспрессию моноцитарного хемотаксического M CP одного гена CCL два. Правая часть рисунка, обозначенная как RD, соответствует РНК пациентов с отслойкой сетчатки, в то время как левая часть, помеченная N, является РНК из контрольной группы, как можно видеть здесь. Отслойка сетчатки приводит к повышению регуляции CCL two, о чем свидетельствуют высокие значения C у большинства образцов RD справа по сравнению с контрольной группой слева.

Это увеличение указывает на воспаление у пациентов с отслойкой сетчатки, как это видно здесь. Экспрессия гена GNAT one, трансдуцирующего фоторецептор палочки, была снижена в противоположность CCL 2, значения низкие для образцов RD справа, снижение экспрессии коротковолнового колбочки опсина O PN one SW, а также наблюдался гомеогенный ген CRX, предполагающий дегенерацию фоторецепторов как палочек, так и колбочек у пациентов с отслойкой сетчатки. Он также может быть применен к другим патологиям сетчатки у животных моделей, таким как наследственные дегенерации сетчатки.

Люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что он требует знаний о нуклеиновых кислотах. Cy.Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение в качестве капитального ремонта, с которым РНК после сертификации сложно справиться.