Кратковременная экспрессия и клеточная локализация рекомбинантных белков в культивируемых клетках насекомых

Общая цель данной процедуры заключается в экспрессии белков интереса с флуоресцентными метками в коммерчески доступных клетках насекомых для более детального изучения функций белков и/или их внутриклеточного транспорта. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы клеточной биологии и биохимии, касающиеся функциональности белков, их взаимодействий и/или субклеточной локализации. Основным преимуществом данной методики является возможность быстрой генерации конструктов и функционального анализа экспрессированных белков в живых клетках без вредоносных эффектов, связанных с экспрессией с помощью бакуловирусов, что позволяет повысить пропускную способность исследований.

Хотя этот метод может быть полезен при изучении белков насекомых, его также можно применять к любой системе, для которой требуется изучение функции белка или его клеточной локализации. Процедуру культивирования и трансфекции клеток насекомых продемонстрирует Данни ЛеРой, технический специалист моей лаборатории. Для начала процедуры изморозьте флаконы со стоковыми культурами замороженных клеток SF9 и Tni из морозильника при -80 °C и дайте им разморозиться в водяной бане при 37 °C.

После размораживания продезинфицируйте флаконы 70% ethanol и поместите их на лед. Все манипуляции с клетками, требующие вскрытия флаконов и колб для культивирования тканей, должны проводиться в ламинарном шкафу для поддержания стерильных условий. Добавьте четыре миллилитра безсывороточной среды для насекомых в новый флакон T25 и четыре миллилитра среды TNM-FH в другой флакон T25.

Перенесите 1 мл размороженных клеток Tni в колбу с безсывороточной средой для насекомых и 1 мл размороженных клеток SF9 в колбу со средой TNM-FH. Поместите колбы в неувлажненный инкубатор при температуре 28 °C и дайте клеткам прикрепиться в течение 30–45 минут. Замените посевную среду на 5 мл соответствующей среды.

Затем верните колбы в не увлажняемый инкубатор при температуре 28 °C. Ежедневно контролируйте конфлюэнтность клеток. Выполняйте пассирование клеток при достижении ими 90% конфлюэнтности, как показано на этих репрезентативных изображениях.

Наклоните колбу с конфлюэнтными клетками так, чтобы среда стекла в один из углов, в сторону от монослоя клеток, и с помощью стерильной серологической пипетки объемом 5 мл осторожно удалите среду, не затрагивая клетки. Для клеток Tni используйте новую стерильную серологическую пипетку объемом 5 мл, чтобы аккуратно добавить 4 мл безсывороточной среды для насекомых на конфлюэнтный монослой. Перемещайте наконечник пипетки по колбе и медленно промывайте поверхность, чтобы удалить слабо прикрепленные к дну колбы клетки.

Чтобы проверить полноту открепления клеток, удалите всю среду, переверните флакон и убедитесь, что его дно чистое. Для клеток SF9, которые прикрепляются сильнее, добавьте 4 mL свежей среды TNM-FH и используйте скребок для клеток, чтобы отделить прикрепившиеся клетки. Используйте серологическую пипетку на 5 mL, чтобы осторожно перемешать суспензию и уменьшить агрегацию клеток.

После отсоединения клеток перенесите примерно 0.1 milliliters каждой смеси клеток и среды в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 milliliter. В отдельную микроцентрифужную пробирку объемом 0.5 milliliter добавьте 10 microliters каждой смеси клеток и среды к 10 microliters трипанового синего. Извлеките предметное стекло с камерой для подсчета клеток из упаковки и добавьте по 10 microliters смеси среды с клетками и трипановым синим на каждую сторону стекла для подсчета.

Поместите предметное стекло в автоматический счетчик клеток и определите плотность и жизнеспособность клеток. Перенесите примерно от 1 до 1,5 × 10⁶ клеток в флаконы T25 со свежей средой. Маркируйте флаконы, указав линию клеток, дату, используемую среду, количество добавленных клеток и номер пассажа.

Поместите колбы в инкубатор при температуре 28 °C на срок до 72 часов. Процедуру трансфекции клеток насекомых также необходимо проводить в ламинарном шкафу. Посейте в колбу T25 до 1 × 10⁶ клеток Tni или SF9 в подходящей среде для клеток насекомых.

В данной демонстрации используются клетки Tni. Культивируйте клетки до достижения конфлюэнтности в течение 72 часов при 18 °C. Через 72 часа удалите и утилизируйте старую среду, затем отделите клетки Tni, добавив четыре миллилитра свежей безсывороточной среды для насекомых, как показано ранее.

Наиболее сложным аспектом данной процедуры является достижение подходящей плотности клеток, прикрепленных к стеклянному дну планшетов во время трансфекции. В каждый планшет следует добавлять не более 7 × 10⁵ клеток. После оценки плотности клеток с помощью автоматического счетчика клеток тщательно, но осторожно перемешайте клеточную суспензию, переворачивая пробирку, и добавьте примерно 7 × 10⁵ клеток в отдельные 35-миллиметровые планшеты со стеклянным дном.

Дайте клеткам прикрепиться в течение 20–25 минут при 28 °C. Для каждой трансфекции добавьте 2 µg плазмидной ДНК в 0,1 мл безсывороточной среды для насекомых без FBS в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. В отдельной пробирке смешайте 8 µL реагента для трансфекции с 0,1 мл безсывороточной среды для насекомых.

Затем перенесите раствор в пробирку, содержащую интересующую вас плазмидную ДНК. Слегка перемешайте на вортексе и инкубируйте при комнатной температуре от 20 до 30 минут. Затем разбавьте смесь для трансфекции плазмиды 0,8 миллилитрами безсывороточной среды для насекомых, чтобы довести общий объем до одного миллилитра.

Осторожно удалите среду из стеклянной чашки с прикрепившимися клетками. Покройте прикрепившиеся клетки разведенной средой для трансфекции плазмидой. Инкубируйте клетки при 28 °C в течение пяти часов.

Через пять часов удалите и утилизируйте среду для трансфекции и осторожно промойте клетки одним миллилитром безсывороточной среды для насекомых, стараясь не сместить клетки. Добавьте два миллилитра свежей безсывороточной среды для клеток насекомых и инкубируйте при 28 °C в течение 48–72 часов. Через 48–72 часа после трансфекции клеток насекомых однократно промойте клетки одним миллилитром среды для насекомых IPL-41, затем добавьте два миллилитра IPL-41 для визуализации.

Добавьте четыре капли реагента для окрашивания живых клеток Hoechst в среду и инкубируйте при 28 °C в течение 20–25 минут. Поместите чашку диаметром 35 мм в закрытую систему лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Несмотря на большое разнообразие доступных в продаже стеклянных чашек, важно, чтобы они подходили к предметному столику микроскопа; может потребоваться эмпирическим путем определить, какая стеклянная посуда обеспечивает наилучшую адгезию клеток.

Настройте микроскоп для условий наблюдения Hoechst, EGFP и mCherry. 359 нм и 461 нм для возбуждения и эмиссии Hoechst. 489 нм и 510 нм для возбуждения и эмиссии EGFP.

И 580 нм и 610 нм для возбуждения и эмиссии mCherry. Используя объектив 10X, проведите предварительное сканирование, чтобы подтвердить флуоресцентную экспрессию. После этого переключитесь в режим сканирования, используя фазово-контрастный объектив с погружением в воду 60X.

Отрегулируйте мощность лазера, чувствительность детектора, скорость сканирования, глубину по оси Z и цифровое увеличение для оптимизации контрастности и разрешения изображения. Снимите изображения клеток с цифровым увеличением 1,5X, чтобы получить общее увеличение 90X. Сохраните и экспортируйте необработанные данные в виде файлов изображений TIFF для последующего анализа.

Клетки Tni трансфицировали указанными плазмидами, а экспрессию рекомбинантных белков визуализировали с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. Успешная трансфекция и экспрессия рекомбинантного BtDrip1-EGFP подтверждаются наличием зеленой флуоресценции на поверхности клеток. Клетки, трансфицированные первой версией BtDrip2-EGFP, демонстрируют внутреннюю зеленую флуоресценцию, что указывает на внутриклеточную экспрессию первой версии BtDrip2.

Аналогично, клетки, трансфецированные PIB DmSPR-mCherry или PIB PLA2G15-mCherry, демонстрируют красную флуоресценцию, что указывает на экспрессию соответствующих химер. На совмещенных изображениях оранжевые или желтые области указывают на экспрессию как EGFP, так и mCherry, что свидетельствует о колокализации белков в одних и тех же субклеточных структурах. Наложение изображений клеток, подвергнутых двойной трансфекции PIB BtDrip1-EGFP и PIB DmSPR-mCherry, указывает на колокализацию BtDrip1-EGFP и DmSPR-mCherry на поверхности клетки.

Клетки, подвергнутые двойной трансфекции BtDrip2 версии один EGFP и PIB DmSPR-mCherry, демонстрируют слабую колокализацию сигналов зеленой и красной флуоресценции, что подтверждает внутриклеточную экспрессию BtDrip2 версии один. Напротив, коэкспрессия PIB BtDrip2 версии один EGFP и лизосомального маркера PIB PLA2G15-mCherry привела к значительному перекрытию зеленых и красных флуоресцентных сигналов в цитоплазме. Это убедительно свидетельствует о том, что BtDrip2 транспортируется в внутриклеточные лизосомы.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как экспрессировать химеры флуоресцентных белков в культивируемых клетках насекомых. Данная система обеспечивает быструю сборку векторов для синтеза белков, позволяет избежать проблем, характерных для систем экспрессии на основе вирусов, и предоставляет надежный способ наблюдения за белками клеточного транспорта.