Кратковременная экспрессия и клеточная локализация рекомбинантных белков в культивируемых клетках насекомых

Общая цель этой процедуры заключается в экспрессии флуоресцентно меченных белков, представляющих интерес, в коммерчески доступных клетках насекомых для более тщательного выяснения функции белка и/или клеточного трафика белков. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы клеточной биологии и биохимии, касающиеся функциональности белка, белковых взаимодействий и/или локализации субклеточных белков. Основное преимущество этого метода заключается в том, что конструкции могут быть быстро сгенерированы и функционально оценены белки в живых клетках без вредных эффектов, связанных с экспрессией бакуловируса, что повышает производительность.

Хотя этот метод может дать представление об изучении белков насекомых, он также может быть применен к любой системе, для которой желательно изучение функции белка или клеточной локализации. Демонстрировать процедуру культивирования и трансфекции клеток насекомых будет Дэнни Лерой, техник из моей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, достаньте стоковые флаконы с замороженными ячейками SF9 и Tni из морозильной камеры при температуре минус 80 градусов Цельсия и дайте им оттаять на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия.

После размораживания обеззаражьте флаконы 70% этанолом и положите их на лед. Все манипуляции с клетками, требующие вскрытия флаконов и колб для тканевых культур, должны выполняться в ламинарном проточном колпаке для поддержания стерильных условий. Добавьте четыре миллилитра бессывороточной среды для насекомых в новую колбу T25 и четыре миллилитра среды TNM-FH в другую колбу T25.

Один миллилитр размороженных Tni-клеток переложить в колбу со средой без сыворотки насекомых и один миллилитр размороженных SF9-клеток в колбу со средой TNM-FH. Поместите колбы в неувлажненный инкубатор с температурой 28 градусов Цельсия и дайте ячейкам прикрепиться в течение 30-45 минут. Замените посевную среду пятью миллилитрами соответствующей среды.

И вернуть колбы в неувлажненный инкубатор с температурой 28 градусов Цельсия. Ежедневно контролируйте слияние клеток. Проходите через клетки, когда они достигнут 90% конфлюенции, как показано на этих репрезентативных изображениях.

Наклоните колбу, содержащую сливающиеся клетки, так, чтобы среда стекала к одному углу от монослоя клеток, и используйте стерильную серологическую пипетку объемом пять миллилитров, чтобы осторожно удалить среду, не повреждая клетки. Для клеток Tni используйте новую стерильную пятимиллилитровую серологическую пипетку, чтобы аккуратно добавить четыре миллилитра бессывороточной среды насекомых на сливающийся монослой. Переместите наконечник пипетки по колбе и медленно орошайте, чтобы удалить клетки, слабо прикрепленные к дну колбы.

Чтобы проверить адекватное отслоение ячеек, удалите все среды, переверните колбу и следите за тем, чтобы дно колбы было чистым. Для клеток SF9, которые прилипают более плотно, добавьте четыре миллилитра свежей среды TNM-FH и используйте скребок для клеток, чтобы выбить прикрепленные клетки. Используйте серологическую пипетку объемом пять миллилитров, чтобы аккуратно перемешать и уменьшить комкование клеток.

После отделения ячеек перенесите примерно 0,1 миллилитра каждой клетки и смеси среды в микропробирку объемом 1,5 миллилитров. В отдельную микропробирку объемом 0,5 миллилитра добавьте по 10 микролитров каждой клетки и средней смеси к 10 микролитрам трипанового синего. Извлеките ячейку счетчика камерного стекла из упаковки и добавьте по 10 микролитров клеточной среды трипановой синей смеси с каждой стороны счетного стекла.

Вставьте предметное стекло в автоматический счетчик клеток и определите плотность и жизнеспособность клеток. Переложите примерно от одного до 1,5 умножить на 10 в 6-ю ячейку в колбы Т25 со свежей средой. Пометьте колбы линией клеток, датой, использованным носителем, количеством добавленных ячеек и номером прохода.

Поместите колбы в инкубатор с температурой 28 градусов Цельсия на срок до 72 часов. Процедура трансфекции клеток насекомых также должна выполняться в колпаке с ламинарным потоком. Посейте в колбу T25 до 10 до 6-й Tni или SF9 клеток в соответствующую среду для клеток насекомых.

В данной демонстрации используются элементы Tni. Выращивайте клетки до слияния в течение 72 часов при температуре 18 градусов Цельсия. Через 72 часа удалите и выбросьте старую среду и вытесните клетки Tni четырьмя миллилитрами свежей среды без сыворотки насекомых, как показано ранее.

Самым сложным аспектом этой процедуры является получение соответствующей плотности клеток, прикрепленных к стеклянным донным чашкам во время трансфекции. В каждое блюдо следует добавлять не более семи раз по 10 до 5-й ячейки. После использования автоматического счетчика клеток для оценки плотности клеток тщательно, но осторожно перемешайте клеточную суспензию, перевернув трубку, и добавьте примерно семь раз по 10-ю к 5-й ячейке в отдельные стеклянные посуды со стеклянным дном диаметром 35 миллиметров.

Дайте элементам прикрепиться на 20-25 минут при температуре 28 градусов Цельсия. Для каждой трансфекции добавляйте два микрограмма плазмидной ДНК к 0,1 миллилитрам бессывороточной среды насекомых без FBS в стерильную микропробирку объемом 1,5 миллилитров. В отдельной пробирке смешайте восемь микролитров реагента для трансфекции с 0,1 миллилитрами бессывороточной среды для насекомых.

Затем перенесите раствор в пробирку, содержащую интересующую плазмидную ДНК. Слегка заворкнуть и выдержать при комнатной температуре от 20 до 30 минут. Далее разведите плазмидную смесь для трансфекции 0,8 миллилитрами бессывороточной среды насекомых, доведя общий объем до одного миллилитра.

Осторожно извлеките среду из стеклянной посуды, содержащей прикрепленные клетки. На прикрепленные клетки наложить разведенную плазмидную среду для трансфекции. Инкубируйте клетки при температуре 28 градусов Цельсия в течение пяти часов.

Через пять часов удалите и выбросьте трансфективную среду и аккуратно промойте клетки одним миллилитром бессывороточной среды для насекомых, стараясь не сместить клетки. Добавьте два миллилитра свежей клеточной среды насекомых без сыворотки и инкубируйте при температуре 28 градусов Цельсия в течение 48-72 часов. Через 48-72 часа после трансфекции клеток насекомого промойте клетки один раз одним миллилитром среды для насекомых IPL-41, а затем накройте двумя миллилитрами IPL-41 для визуализации.

Добавьте четыре капли реагента для окрашивания живых клеток Hoechst в среду и инкубируйте при температуре 28 градусов Цельсия в течение 20-25 минут. Поместите 35-миллиметровую тарелку в самозакрытый лазерный сканирующий конфокальный микроскоп. Несмотря на то, что многие стеклянные посуды имеются в продаже, важно, чтобы они подходили для предметного столика микроскопа, и может потребоваться эмпирическое определение того, какая стеклянная посуда наиболее совместима с клеточным креплением.

Настройте микроскоп для условий наблюдения Hoechst, EGFP и mCherry. 359 нанометров и 461 нанометр для возбуждения и излучения Хёхста. 489 нанометров и 510 нанометров для возбуждения и излучения EGFP.

А также 580 нанометров и 610 нанометров для возбуждения и излучения mCherry. Используя объектив 10X, выполните первоначальное сканирование, чтобы подтвердить экспрессию флуоресценции. После этого переключитесь в режим сканирования с помощью объектива для погружения в воду с 60-кратным фазовым контрастом.

Отрегулируйте мощность лазера, чувствительность детектора, скорость сканирования, глубину по оси Z и цифровой зум для оптимизации контрастности и разрешения изображения. Визуализируйте ячейки с 1,5-кратным цифровым зумом, чтобы получить общее 90-кратное усиление. Сохраните и экспортируйте необработанные данные в виде файлов изображений TIFF для последующего анализа.

Tni-клетки трансфицировали указанными плазмидами и визуализировали экспрессию рекомбинантных белков с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. Успешная трансфекция и экспрессия рекомбинантного BtDrip1-EGFP проявляется в наличии зеленой флуоресценции на поверхности клетки. Клетки, трансфицированные BtDrip2 версии 1 EGFP, демонстрируют зеленую флуоресценцию, указывающую на внутриклеточную экспрессию BtDrip2 версии 1.

Аналогичным образом, клетки, трансфицированные PIB DmSPR-mCherry или PIB PLA2G15-mCherry, демонстрируют красную флуоресценцию, указывающую на экспрессию соответствующих химер. На объединенных изображениях оранжевые или желтые области указывают на экспрессию как EGFP, так и mCherry, что позволяет предположить, что белки колакализованы в одних и тех же субклеточных структурах. Наложение клеток, дважды трансфицированных PIB BtDrip1-EGFP и PIB DmSPR-mCherry, предполагает совместную локализацию BtDrip1-EGFP и DmSPR-mCherry на поверхности клетки.

Клетки, дважды трансфицированные BtDrip2 версии 1 EGFP и PIB DmSPR-mCherry, демонстрируют небольшую колокализацию зеленых и красных сигналов флуоресценции, подтверждающих внутриклеточную экспрессию BtDrip2 версии 1. Напротив, коэкспрессия PIB BtDrip2 версии первого EGFP и маркера лизосомы PIB PLA2G15-mCherry привела к значительному перекрытию цитоплазматических зеленых и красных флуоресцентных сигналов. Это убедительно свидетельствует о том, что BtDrip2 является трафиком к межклеточным лизосомам.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как экспрессировать флуоресцентные белковые химеры в культивируемых клетках насекомых. Эта система обеспечивает быстрое построение векторов в синтезе белка, позволяет избежать проблем, связанных с системами экспрессии вирусов, и предоставляет надежные средства для наблюдения за клеточными транспортными белками.