Проточной цитометрии бимолекулярного флуоресценции Комплементация: Высокая пропускная способность Количественный метод изучения взаимодействия белок-белок

Общей целью данной процедуры является картирование мест взаимодействия ACAP LBC с PDE четыре, D три. Путем измерения средней интенсивности флуоресценции биомолекулярной, флуоресцентной, комплементации или РМЖ с помощью проточной цитометрии. Для этого клетки трансфицируют с помощью ACAP LBC и PDE: четыре D, три фрагмента, слитые с N или C концевой частью флуоресцентного репортерного белка.

Затем проводится проточная цитометрия Венеры для оценки флуоресценции, взаимодействуют ли фрагменты белка и флуоресценция. Если фрагменты белка не взаимодействуют, флуоресценция не обнаруживается. Комплементарный западный анализ крови проводится для определения относительных уровней экспрессии белка.

Затем сила белковых взаимодействий рассчитывается путем нормализации средней интенсивности флуоресценции YFP в соответствии с уровнями экспрессии белка. Полученные данные указывают на то, что связывание PDE 43 с ACAP LBC опосредовано несколькими областями внутри PDE 43, в первую очередь через первую консервативную область или UCR one. Основные преимущества этой методики перед существующими методами заключаются в том, что она относительно проста, чувствительна и способствует быстрому скринингу большого количества клеток.

Хотя этот метод может дать представление о белок-белковых взаимодействиях, он также может быть использован для скрининга факторов, регулирующих белок-белковые взаимодействия, для разработки лекарств. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что необходимо определить линейный ответ В. Выражение конструкта должно быть сходным, чтобы в результате использования различных фрагментов белка можно было сравнивать друг с другом.

В описанных здесь экспериментах клетки были трансфицированы N-концевым фрагментом производного YFP, Венера была слита с полноразмерным ACAP LBC, а С-концевой фрагмент Венеры был слит с одним из следующих полноразмерных PDE E 43, с восходящей консервативной областью one UCR one of PDE E 43 или с восходящей консервативной областью two плюс каталитическая область UCR R two плюс CAT PDE 43 за день до трансфекции в Шесть. Ну а в тканевые культуральные планшеты затравливают 1,2 раза по 10 до пятой ГЭЦ 2 9 3 Т-клеток на лунку в два миллилитра полного роста. Средний затравка, три контрольные лунки плюс по три лунки на каждый из теста.

Котран инкубируется при 5% углекислом газе при 37 градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день готовят к трансфекции конструкций ДНК плазмы РЦ и вектора CFP, который в качестве маркера трансфицируют конструктами БС С. Для каждого состояния добавьте соответствующее количество ДНК к 250 микролитрам свободной сыворотки Optum M1

В стерильной пробирке достаточно одной пробирки для трансфекции трех лунок. Затем добавьте три микролитра транзита ЛТ, по одному реагенту на каждый микрограмм в разведенную смесь ДНК и пипеткой аккуратно перемешайте, инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации при 250 микролитрах трансфекционной смеси по каплям в клетки затем инкубируют при 5% углекислом газе при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов.

После трансфекции проверьте флуоресценцию под эпифлуоресцентным микроскопом, клетки должны экспрессировать желтую флуоресценцию для сигнала BC и флуоресценцию CFP для сообщения об эффективности трансфекции. Чтобы подготовить клетки к проточному цитометрическому анализу, сначала промойте их двумя миллилитрами ледяного PBS, затем отделите клетки, добавив 250 микролитров 0,05%-ного трипсина, инкубируйте в течение двух-пяти минут при 37 градусах Цельсия. Затем с помощью микроскопа проверяют на предмет отслойки клеток.

Как только клетки отделятся, нейтрализуйте трипсин одним миллилитром DMEM. Затем перенесите один миллилитр клеток в одну микроцентрифужную пробирку, затем переложите 0,25 миллилитра клеток во вторую микроцентрифужную пробирку. Крутите трубочки на 500 сыров в течение пяти минут.

Образец объемом 250 микролитров будет дополнительно обработан для проточной цитометрии. Отложите образец в один миллилитр на лед для западного анализа крови, который следует выполнять параллельно после спина Резус. Суспензируйте клетки в 250 микролитрах факс-буфера и поместите их на лед, клетки также могут быть зафиксированы в 1%-ном параформном альдегиде в PBS Если анализ проточной цитометрии здесь не будет мгновенным, проточная цитометрия выполняется с помощью голубого принтера Beckman Coulter, DP, оснащенный твердотельными лазерами 488 нанометров, 405 нанометров и 642 нанометров, программное обеспечение для сбора и анализа после калибровки проточного цитометра с использованием стандартных шариков, построение прямого рассеяния или FSC в сравнении с боковым рассеянием SSC в линейном масштабе и походка на популяции живых клеток.

Далее построим график зависимости SSC от длительности импульса напряжения и походки на неагрегированной популяции живых клеток. Затем построите график FSC в линейной шкале в зависимости от флуоресценции CFP при 405 FL 6 на этом приборе в логарифмическом масштабе и пройдите по неагрегированным живым CFP-положительным клеткам. Наконец, построите график FSC в линейном масштабе в зависимости от флуоресценции YFP при 488 нанометрах FL единица на этом инструменте на логарифмическом масштабе, чтобы визуализировать интенсивность BC.

Затем запустите двойной отрицательный образец Y-F-P-C-F-P и отрегулируйте фотоумножитель F-S-C-S-C FL one и FL six или напряжение ФЭУ, чтобы установить порог для каждого сигнала. Затем запустите одиночные положительные образцы YFP и CFP для будущей компенсации в автономном режиме. Обязательно приобретите не менее 10 000 закрытых мероприятий.

Наконец, соберите данные для экспериментальных образцов после сбора данных. Настройте протокол анализа в соответствии с регистрацией с распространением с помощью первого затвора на точечной диаграмме FS CSC для живых клеток. Второй вентиль в FSC-импульсе с точечной диаграммой первого затвора для неагрегированных живых клеток и третьим вентилем на точечной диаграмме ccfp FSC второго затвора для неагрегированных ccfp-положительных живых клеток.

После компенсации сигнала YFP и CCFP на точечной диаграмме Y fp CFP с использованием одиночных положительных ячеек YFP и CFP мы определяем линии отсечения для CFP и YFP положительных клеток. Экспортируйте среднюю интенсивность флуоресценции YFP или MFI положительных клеток CFP в excel для построения графиков данных, затем в Excel нормализуйте Y-F-P-M-F-I до уровня экспрессии ACAP, LBC, PDE E 43 и нагрузите контроль альфа-тубулина, как определено с помощью вестерн-блоттинга, чтобы определить линейный диапазон средней интенсивности флуоресценции YFP. CFP был пересечен с помощью VN ACAP L BBC и различных количеств VC PDE E 43 в клетках HEC 2 93, а взаимодействие оценивали с помощью проточной цитометрии bif, как описано в этом видео, на этом графике показано относительное изменение экспрессии VC PDE E 43 в зависимости от трансфицированного VC PDE E 43.

Средняя интенсивность флуоресценции Венеры в CFP-положительных клетках, обозначенная синими квадратами, коррелировала с экспрессией VCDE 43 и соответствовала уровням экспрессии, определенным при анализе изображения вестерн-блоттинга, который обозначен красными треугольниками. Аналогичная средняя интенсивность флуоресценции CFP наблюдалась среди образцов, как указано зелеными квадратами, и использовалась в качестве отрицательного контроля для ограничения вариаций клеток. Эти результаты подтверждают использование проточной цитометрии для количественной оценки взаимодействия ACAB LB C PDE 43 путем измерения средней интенсивности флуоресценции BS e и в то же время определения надлежащего количества конструкций BIC, используемых для скрининга для картирования сайтов связывания ACAP LBC в PDE E 43 BIC анализ взаимодействия ACAP LBC с полноразмерным PDE E 43 fl.

UCR одна область PDE 43 и UCR 2, а также CAT области PDE 43 оценивались с использованием этого метода, как показано здесь. Экспрессия vn ACAP LBC и VC PDE 43 UCR two plus CAT приводит к более низкому сигналу BC по сравнению с VC PDE 43 FL и VC PDE 43 UCR. Во всех проточных образцах наблюдалась одна сходная экспрессия белка, а средняя флуоресценция нормализована до относительных уровней экспрессии ACAP, LBC, PDE 43 и альфа-тубулина. Таким образом, нормализованный B-C-M-F-I указывает на то, что нет разницы в интенсивности флуоресценции между ACAP LBC PDE 43 FL и ACAP LBC PDE 43 UCR R one, но значительно меньший сигнал для ACAP LBC PDE 43 UCR two плюс взаимодействие CAT.

Эти результаты свидетельствуют о том, что в PDE 43 есть несколько областей, которые взаимодействуют с ACAP LBC, и что PDE 43 UCR R one является основной областью взаимодействия с ACAP LBC. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изучать белок, взаимодействие белков с помощью анализа проточной цитометрии BP C. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости определения правильного количества конструкции BP C, используемого для получения аналогичной экспрессии белка и линейного ответа BP C. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как пептид или риск, чтобы определить, какие аминокислоты в составе PDE 40 D 3 ответственны.

Его взаимодействия с ACAP RBC.