Бимолекулярные флуоресценции комплементации

Этот эксперимент направлен на то, чтобы определить, взаимодействуют ли два белка в клетках, и очертить аспекты участков этого взаимодействия. Во-первых, клетки трансфицируют экспрессирующими конструкциями, кодирующими два представляющих интерес белка, один из которых сливается с конечным концом фрагментированного флуоресцентного белка, а другой — с комплементарным С-концом фрагментированного флуоресцентного белка. После того, как трансфицированные клетки получили возможность развить флуоресцентный сигнал в культуре, белковые комплексы визуализируются с помощью визуализации и иммуноблоттинга.

Затем собранные изображения экспортируются в программное обеспечение для визуализации, такое как Image J. Чтобы количественно оценить среднюю интенсивность флуоресценции на клетку в контролируемом эксперименте, результаты BIFC могут продемонстрировать взаимодействия белковых белков и локализацию этих комплексов, таких как пересечение трех доменов SH белка скаффолда и про богатый домен PI трех KC two beta. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как колокализация, иммунопреципитация и лады, заключается в том, что BFC позволяет пространственно локализовать более слабые переходные взаимодействия в клетке. И этот метод не требует обширной постобработки изображений, как это видно на ладах.

Этот метод может решить ключевые вопросы в области передачи сигнала, такие как взаимодействуют ли белки X и Y, и если да, то в каких специфических компартментах эти комплексы локализованы в клетке? Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности, потому что они не выбрали правильную конфигурацию для экспрессии биопсии. Помеченные белки, представляющие интерес Начните с выбора одного из нескольких флуорофоров для гибридных белков BIFC.

Учтите, что амино- и карбоксильные концевые концы Венеры способны образовывать комплекс при 37 градусах Цельсия, в то время как фрагменты Y-F-P-B-I-F-C требуют предварительной инкубации при 30 градусах Цельсия. Разработайте векторы экспрессии для добавления меток к интересующим белкам, рассмотрев, как прикрепление фрагментов BIFC может повлиять на функцию представляющих интерес белков. Например, семейство RA, GTP A являются липидами, модифицированными на карбокси-конце, и не могут быть помечены на этом конце без нарушения этой модификации.

Всегда проводите пилотные эксперименты для определения условий трансфекции. Также контролируйте клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы определить оптимальное время для развития сигнала. Затем проведите анализ западного цветения, чтобы подтвердить равное выражение конструкций.

Важно отметить, что иммуноокрашивание для ГК или флаг-метки для проверки того, что добавление фрагментов BIFC не изменяет клеточную локализацию белков, представляющих интерес для каждого образца планшета. 1,3 умножить на 10 из пяти клеток на одну стеклянную дно-материальную пластину и две лунки шестилуночной пластины и позволить клеткам осесть на ночь в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия на следующий день. Подготовьте ДНК для трансфекции методом липэктомии или другим предпочтительным методом.

Во-первых, разбавьте ДНК в 250 микролитрах сывороточного свободного DMEM в качестве контроля трансфекции. Прибавьте CFP к единице 50, чтобы получить общее количество ваших ДНК BIFC. Теперь разведите губу в 250 микролитрах сыворотки без DMEM, используя 10 микролитров губы на один микрограмм ДНК.

Смешайте ДНК и разведите губы, инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут. Дважды промойте клетки теплой сывороткой DMEM. Добавьте два миллилитра бессывороточного DMEM в каждую стеклянную нижнюю тарелку или лунку шестилуночной посуды.

Затем разделите каждую смесь для трансфекции поровну между одной чашкой со стеклянным дном и двумя лунками по шестерке. Хорошо планшет инкубируют клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти часов. Наконец, удалите трансфекционный фильтрующий материал и замените его на полный DMEM плюс 10% FBS-фильтрующий материал.

Инкубируйте клетки в течение времени, определенного в пилотных экспериментах, чтобы получить необходимые уровни экспрессии интересующих белков. Исследуйте трансфицированные клетки под эпифлуоресцентным микроскопом, чтобы убедиться, что положительный контроль является флуоресцентным. Трижды промойте клетки с помощью PBS для визуализации живых клеток.

Поместите клетки в среды, в которых отсутствует индикатор штампов. Для визуализации неподвижных клеток. Добавьте 2% параформальдегида и положите на лед на 10 минут.

Затем трижды промойте клетки PBS, теперь покрытым одним миллилитром PBS, и храните в темноте при четырех градусах Цельсия, немедленно излив клетки в чашке с шестью лунками. Для вестерн-блоттинга важно, чтобы все клетки были подготовлены одновременно, чтобы клетки lys были репрезентативными для клеток изображения. Проведите вестерн-блоттинг, чтобы убедиться, что белки-метки экспрессируются на эквивалентных уровнях.

При визуализации клеток с помощью конфокального микроскопа важно поддерживать постоянные настройки на протяжении всего эксперимента, чтобы флуоресценция была сопоставима между образцами. Обязательно визуализируйте отдельные ячейки, в которых пиксели не насыщены. Поскольку CFP был включен в качестве трансфекционного контроля, выбирайте только положительные CFP клетки для анализа сигналов BIFC.

Количественное определение флуоресценции с помощью программного обеспечения для обработки изображений, такого как изображение J. Откройте файлы изображений в Image J.Go для анализа заданных измерений. Установите флажки для площади и среднего значения серого в поле измерений. Обратите внимание, что в этом примере венозные изображения были псевдоокрашены зеленым цветом, а изображения CFP — псевдоокрашены в красный цвет.

С помощью инструмента выделения от руки нарисуйте контур по краю всей ячейки в канале CFP, оставив этот контур на месте. Переход на канал YFP. Перейдите к анализу, измерьте среднее значение серого, отражающее среднюю интенсивность флуоресценции на ячейку для каждого изображения.

Нарисуйте круг в канале YFP в области, не содержащей ячейки. Сделайте замер для этой области в качестве фона. Вычтите фон из каждого изображения.

Наконец, чтобы рассчитать среднюю интенсивность флуоресценции для популяции клеток, усредните среднее значение степени за вычетом фона для всех клеток, изображенных в одном образце. В идеале необходимо количественно определить 60 клеток в трех экспериментах. Пересечение многодоменного скаффолдингового белка регулирует выживаемость нейронов путем регуляции нового класса два: PI три киназы, PI три KC, два бета пересекающихся SH, три домена взаимодействуют с аминоконцевым пролин-богатым участком PI три KC два бета трансфекции VN меченого пересекающегося с VC меченного PI три KC два бета приводит к флуоресцентному сигналу в канале YFP, который имеет псевдоокрашенный зеленый цвет, указывающий на образование комплекса.

Псевдо CFP, окрашенный здесь в красный цвет, используется в качестве контроля для обозначения мутаций трансфицированных клеток в богатом пролином домене PI три KC two beta, которые нарушают совместное осаждение пересекающихся и PI три KC two beta снижают сигнал BIFC. Эта разница в сигнале BIFC не связана с различиями в экспрессии дикого типа и трех К-белков PA PI. После освоения эта техника может быть выполнена за три дня, если все сделано правильно. Выполняя эту процедуру, вы должны помнить о том, что необходимо запустить надлежащий контроль и проверить экспрессию белка, чтобы убедиться, что различия в сигнале BC обусловлены различиями в образовании комплекса, а не экспрессией после этой процедуры.

Другие методы, такие как поверхностная плазма на резидентах, могут быть применены для того, чтобы ответить на такие вопросы, как: каково различное сродство этих комплексов друг к другу?