Использование изображения Цитометрии для количественного определения патогенных грибов в связи с клетки-хозяева
19 июня 2013 г.
Здесь показано, как изображение цитометрии может использоваться для количественного определения патогенных грибов в связи с хост клеток в культуре. Этот метод может быть использован в качестве альтернативы перечисление КОЕ.
Общая цель этой процедуры заключается в количественном определении патогенных дрожжей в ассоциации с клетками хозяина без выделения колониеобразующих единиц. Во-первых, инфицируйте клетки макрофагов с помощью H-капсуляции или дрожжевых клеток C. albicans, окрашивайте инфицированные клетки макрофагов айн-апельсином и йодидом пропидия, чтобы выделить жизнеспособные дрожжевые клетки. Затем с помощью цитометра с помощью визуализации можно получить серию изображений и проанализировать размер и параметры формы, чтобы точно подсчитать дрожжевые клетки.
Результаты графической цитометрии могут быть эффективно использованы для количественного определения патогенных дрожжей в ассоциации с клетками-хозяевами. Идея этого метода впервые пришла мне в голову, когда я проводил исследования в области грибкового патогенеза, в которых мне приходилось неоднократно определять и подсчитывать колониеобразующие единицы для количественного определения патогенного гриба Histoplasma capsule. Основным преимуществом графической цитометрии перед стандартным методом подсчета КОЕ является ее повышенная скорость, так как она исключает трудоемкие и трудоемкие этапы осаждения, инкубации и подсчета многократных серийных разведений КОЕ при сравнении роста дикого типа и мутантных штаммов в клетках-хозяевах.
Этот метод устраняет потенциальную систематическую ошибку, вызванную различными способностями инициировать качественный рост на твердых носителях. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут столкнуться с проблемой с помощью цитометрии изображения. Контрольно-измерительные приборы и программное обеспечение.
Начните процедуру с культивирования макрофагов с желаемой плотностью. В 24-луночные планшеты добавьте грибковые клетки в логарифмической фазе роста, затем инкубируйте в течение 90 минут, чтобы обеспечить фагоцитоз. Затем трижды промывают макрофаги PBS для удаления внеклеточных грибов. Инкубируйте в течение экспериментально определенных временных точек перед анализом образца при низкой кратности инфекции, инфицированные клетки макрофагов остаются жизнеспособными в течение нескольких дней, а образцы можно анализировать примерно каждые 12-24 часа.
После трех промываний PBS добавьте 0,5 миллилитра стерильной воды в инфицированные клетки макрофагов. Инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы освободить грибы от клеток макрофагов. Затем соберите лизат в стерильную пробирку и держите на льду.
Переложите 20 микролитров лизата в отдельную пробирку. Добавьте 20 микролитров раствора йодида пропидия апельсина для немедленного цитометрического анализа изображения. Выполняют десятикратное разведение лизатов в средах.
Затем в пластину вливают по 100 микролитров каждого разведения в двух экземплярах. На пластинах HMM aros. Инкубируйте планшеты во влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение семи-восьми дней.
Вручную подсчитайте колонии на табличках, отображая минимум 100 и максимум 1000 отдельных колоний. Чтобы собрать живые макрофаги, трижды промойте клетки PBS. Затем добавьте 0,5 миллилитра PBS и выдерживайте 30 минут при четырех градусах Цельсия.
Удалите макрофаги из лунок для культуры тканей с помощью щадящего пипетирования. Переложите жидкость в стерильную пробирку и храните на льду. Чтобы настроить акселерометр, вставьте модули флуоресцентной оптики в систему и убедитесь, что они зафиксированы на месте.
Включите цитометр изображения в выпадающем меню анализа программного обеспечения. Выберите предустановленный тип анализа и тип клеток для обеспечения жизнеспособности. Анализ оптимизирован для обнаружения айне-апельсина и йодида пропидиума для выявления инфекции Candida albicans.
Анализ оптимизирован для обнаружения GFP. Теперь откройте вкладку «Параметры» и нажмите «Сделать фоновое изображение» После завершения операции нажмите на предварительный просмотр яркого изображения для измерения жизнеспособности A OPI. Смешайте 20 микролитров образца с 20 микролитрами A OPI и внесите пипетку в камеру для определения уровня инфицирования Candida albicans.
Хорошо перемешайте образец и отправьте его пипеткой прямо в счетную камеру. После того, как клетки осядут в камере, вставьте счетную камеру в цитометр для получения изображения. Сфокусируйтесь на образце, затем нажмите на счет.
Когда операция получения изображения будет завершена, снимите одноразовую счетную камеру и утилизируйте ее надлежащим образом. Для измерения A OPI результаты концентрации и жизнеспособности отображаются на странице результатов подсчета для определения уровня инфекции Candida albicans. После получения результатов подсчета нажмите на экспорт.
Затем отправьте данные в FCS express four для анализа популяции клеток GFP. В FCS express импортируйте файл данных и отобразите результаты на флуоресцентной гистограмме. Затем примените ворота клеточной популяции к гистограмме, чтобы определить процент популяции инфицированных клеток Candida albicans.
В этом эксперименте отслеживается рост клеток макрофагов, инфицированных дрожжами hcaps Lotum, в определенные моменты времени. Образцы окрашиваются и анализируются с помощью цитометрии на основе изображений. Высвобожденные дрожжевые клетки из шнурованных макрофагов идентифицируются с помощью программного обеспечения для зрения Сотера.
При этом абсолютное количество обнаруженных живых дрожжей больше, чем дрожжей, способных к образованию колоний на твердой среде. Эти данные подчеркивают наличие значительного количества жизнеспособных, но не поддающихся культивированию клеток. Эти макрофаги, полученные из костного мозга, были инфицированы дрожжевыми клетками C. albican, экспрессирующими зеленый флуоресцентный белок под контролем промотора A DH one.
Кратность инфекции в диапазоне от 0,1 до 10 приводила к постепенному увеличению интенсивности GFP в инфицированных макрофагах, а также общего процента инфицированных макрофагов после освоения. Этот метод может быть выполнен всего за несколько минут на образце, если он выполнен правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно не забывать устанавливать параметры таким образом, чтобы учитывались только грибковые клетки, а не клетки-хозяева.
После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать цитометрию изображения для количественного определения патогенных дрожжей в ассоциации с клетками хозяина. Не забывайте, что работа с патогенными грибами может быть крайне опасной, поэтому носите средства индивидуальной защиты и соблюдайте надлежащие процедуры утилизации биологически опасных отходов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании демонстрируется использование имидж-цитометрии для количественного определения патогенных грибов в ассоциации с клетками хозяина в культуре. Этот метод служит эффективной альтернативой традиционному подсчету колониеобразующих единиц (КОЕ).
Основные компоненты исследования
Область науки
- Патогенез грибковых инфекций
- Клеточная микробиология
- Методы количественной визуализации
Теоретическая часть
- Количественное определение патогенных дрожжей традиционными методами может быть затруднительным.
- Подсчет КОЕ является трудоемким и длительным процессом.
- Проточная цитометрия с визуализацией представляет собой более быструю альтернативу для количественного анализа.
- Данное исследование посвящено взаимодействию макрофагов и патогенных дрожжей.
Цель исследования
- Количественное определение патогенных дрожжей в клетках хозяина без использования методов подсчета КОЕ.
- Повышение эффективности количественного анализа грибковых инфекций.
- Предоставление надежного метода анализа взаимодействий между дрожжами и клетками.
Используемые методы
- Инфицирование макрофагов клетками H capsulation или дрожжевыми клетками C albicans.
- Окрашивание инфицированных клеток аниловым оранжевым и пропидиййодидом.
- Захват изображений с помощью имиджингового цитометра.
- Анализ параметров размера и формы для подсчета количества дрожжевых клеток.
Основные результаты
- Проточная цитометрия с анализом изображений позволяет эффективно количественно определить патогенные дрожжи в клетках хозяина.
- Данный метод сокращает временные и трудовые затраты, связанные с подсчетом КОЕ.
- Результаты могут быть использованы для сравнения роста штаммов дикого типа и мутантных штаммов.
- Эта методика расширяет возможности изучения патогенеза грибковых инфекций.
Выводы
- Проточная цитометрия с визуализацией является жизнеспособной альтернативой подсчету КОЕ.
- Данный метод оптимизирует процесс количественного анализа для исследователей.
- Он открывает новые возможности для изучения взаимодействий между хозяином и патогеном.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественное определение патогенных грибов в клетках хозяина имеет решающее значение для валидации мишеней и идентификации ведущих соединений при разработке противогрибковых препаратов. Традиционный подсчет КОЕ характеризуется медленным ростом, вариабельной эффективностью посева и трудоемкостью рабочих процессов, что ограничивает пропускную способность при сравнении штаммов и изучении механизмов действия. Проточная цитометрия с анализом изображений представляет собой быструю, чувствительную и экономичную альтернативу, позволяющую количественно оценивать жизнеспособность дрожжей и их внутриклеточный рост без посева на чашки, что повышает прогностическую достоверность доклинического скрининга противогрибковых средств.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения внутриклеточного роста дрожжей в макрофагах, что проясняет динамику взаимодействия патогена и хозяина.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством прямого измерения количества жизнеспособных дрожжей в клетках хозяина, снижая зависимость от суррогатных конечных точек.
- Прогностическая ценность: повышает прогностическую уверенность и эффективность отбора перспективных кандидатов за счет обнаружения жизнеспособных, но некультивируемых популяций дрожжей, которые не выявляются методом CFU, что повышает точность сравнения штаммов.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: подготовка валидированных биологических систем (кокультур дрожжей и макрофагов) для последующего скрининга противогрибковых соединений с использованием стандартизированных протоколов инфицирования и лизиса.
- Количественные результаты: обеспечение воспроизводимого подсчета дрожжевых клеток на основе их размера и формы с помощью окрашивания акридиновым оранжевым и пропидийиодидом и имиджинговой цитометрии, что позволяет надежно оценивать эффективность соединений.
- Масштабируемость: возможность повторного использования платформы для различных грибковых патогенов (например, Histoplasma capsulatum, Candida albicans) и анализа мутантных штаммов, что повышает пропускную способность скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Моделирует патогенез грибковых инфекций у человека путем количественного определения репликации дрожжей в фагосомах макрофагов, что соответствует стратегиям трансляционных биомаркеров для оценки нагрузки внутриклеточных патогенов.
- Преклиническая преемственность: Связывает этап поиска и преклиническую валидацию, предоставляя количественные показатели инфекции в динамике, что обосновывает принятие решений о продвижении разработки с учетом рисков.
- Снижение механистических рисков: Направлено на прогностическое снижение рисков путем выявления расхождений между КОЕ и фактическим количеством жизнеспособных дрожжей, что подчеркивает ограниченность традиционных тестов на жизнеспособность.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод интегрируется в общий процесс поиска противогрибковых средств — от ранней валидации мишеней и идентификации соединений-лидеров до доклинических испытаний эффективности, обеспечивая количественную оценку противогрибковых соединений в физиологически релевантных моделях взаимодействия «хозяин-патоген».
- Открывательная биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей путем количественной оценки выживаемости и репликации дрожжей внутри клеток хозяина при генетическом или фармакологическом воздействии.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированных рабочих процессов инфицирования, лизиса и окрашивания, которые дают воспроизводимые количественные результаты для скрининга библиотек соединений.
- Аналитика: позволяет получать показатели количества и жизнеспособности дрожжей на основе их размера и формы с помощью имидж-цитометрии, что облегчает сравнение условий действия противогрибковых средств и фенотипов штаммов.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями путем моделирования внутриклеточного роста грибов в макрофагах, что является ключевым признаком вирулентности при системных микозах.
- Корпоративное повторное использование: служит многофункциональной платформой для количественного анализа различных видов грибов и типов клеток хозяина, сокращая затраты на повторную разработку методов анализа.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность валидации мишени за счет выявления жизнеспособных популяций дрожжей, которые не обнаруживаются методом CFU, что снижает механистическую неопределенность в исследованиях механизмов действия противогрибковых препаратов.
- Операционная ценность: Повышает стандартизацию и воспроизводимость за счет автоматизированного получения и анализа изображений, сводя к минимуму зависимость подсчета дрожжей от конкретного пользователя.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет получения более быстрых и точных данных о кинетике инфекции, что сокращает временные и ресурсные затраты на ранних этапах скрининга противогрибковых средств.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритезацию с учетом рисков путем идентификации соединений, эффективных против внутриклеточных резервуаров дрожжей, что устраняет ключевой недостаток современных противогрибковых препаратов.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области патогенеза грибков, культивирования макрофагов и флуоресцентной микроскопии для обеспечения точного разграничения дрожжей и клеток хозяина.
- Метод зависит от наличия оборудования для имиджинговой цитометрии (например, Cellometer Vision) с флуоресцентной оптикой и программного обеспечения для анализа жизнеспособности с целью детекции акридинового оранжевого/пропидия иодида и GFP.
- Необходима межкомандная стандартизация времени инфицирования, множественности заражения (MOI) и протоколов лизиса для обеспечения воспроизводимого высвобождения и количественного определения дрожжей.
- Требуется учет особенностей адаптации для различных видов грибков (например, штаммов, экспрессирующих GFP) и типов клеток хозяина (например, первичных макрофагов в сравнении с клеточными линиями) для поддержания специфичности сигнала.
- Возможности ограничены необходимостью оптимизации параметров окрашивания и визуализации для исключения сигналов клеток хозяина и предотвращения избыточного подсчета, особенно в образцах с высоким уровнем фонового шума.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
1:39
Infection of Macrophages with H. capsulatum, C. albicans
2:21
Macrophage Lysis
2:56
CFU Plating
3:28
Visualization of Fungi within Live Macrophages
3:54
Image Cytometric Analysis
6:04
Results: H. capsulatum in Macrophage Cells
7:12
Conclusion
