Использование изображения Цитометрии для количественного определения патогенных грибов в связи с клетки-хозяева

Общая цель этой процедуры заключается в количественном определении патогенных дрожжей в ассоциации с клетками хозяина без выделения колониеобразующих единиц. Во-первых, инфицируйте клетки макрофагов с помощью H-капсуляции или дрожжевых клеток C. albicans, окрашивайте инфицированные клетки макрофагов айн-апельсином и йодидом пропидия, чтобы выделить жизнеспособные дрожжевые клетки. Затем с помощью цитометра с помощью визуализации можно получить серию изображений и проанализировать размер и параметры формы, чтобы точно подсчитать дрожжевые клетки.

Результаты графической цитометрии могут быть эффективно использованы для количественного определения патогенных дрожжей в ассоциации с клетками-хозяевами. Идея этого метода впервые пришла мне в голову, когда я проводил исследования в области грибкового патогенеза, в которых мне приходилось неоднократно определять и подсчитывать колониеобразующие единицы для количественного определения патогенного гриба Histoplasma capsule. Основным преимуществом графической цитометрии перед стандартным методом подсчета КОЕ является ее повышенная скорость, так как она исключает трудоемкие и трудоемкие этапы осаждения, инкубации и подсчета многократных серийных разведений КОЕ при сравнении роста дикого типа и мутантных штаммов в клетках-хозяевах.

Этот метод устраняет потенциальную систематическую ошибку, вызванную различными способностями инициировать качественный рост на твердых носителях. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут столкнуться с проблемой с помощью цитометрии изображения. Контрольно-измерительные приборы и программное обеспечение.

Начните процедуру с культивирования макрофагов с желаемой плотностью. В 24-луночные планшеты добавьте грибковые клетки в логарифмической фазе роста, затем инкубируйте в течение 90 минут, чтобы обеспечить фагоцитоз. Затем трижды промывают макрофаги PBS для удаления внеклеточных грибов. Инкубируйте в течение экспериментально определенных временных точек перед анализом образца при низкой кратности инфекции, инфицированные клетки макрофагов остаются жизнеспособными в течение нескольких дней, а образцы можно анализировать примерно каждые 12-24 часа.

После трех промываний PBS добавьте 0,5 миллилитра стерильной воды в инфицированные клетки макрофагов. Инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы освободить грибы от клеток макрофагов. Затем соберите лизат в стерильную пробирку и держите на льду.

Переложите 20 микролитров лизата в отдельную пробирку. Добавьте 20 микролитров раствора йодида пропидия апельсина для немедленного цитометрического анализа изображения. Выполняют десятикратное разведение лизатов в средах.

Затем в пластину вливают по 100 микролитров каждого разведения в двух экземплярах. На пластинах HMM aros. Инкубируйте планшеты во влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение семи-восьми дней.

Вручную подсчитайте колонии на табличках, отображая минимум 100 и максимум 1000 отдельных колоний. Чтобы собрать живые макрофаги, трижды промойте клетки PBS. Затем добавьте 0,5 миллилитра PBS и выдерживайте 30 минут при четырех градусах Цельсия.

Удалите макрофаги из лунок для культуры тканей с помощью щадящего пипетирования. Переложите жидкость в стерильную пробирку и храните на льду. Чтобы настроить акселерометр, вставьте модули флуоресцентной оптики в систему и убедитесь, что они зафиксированы на месте.

Включите цитометр изображения в выпадающем меню анализа программного обеспечения. Выберите предустановленный тип анализа и тип клеток для обеспечения жизнеспособности. Анализ оптимизирован для обнаружения айне-апельсина и йодида пропидиума для выявления инфекции Candida albicans.

Анализ оптимизирован для обнаружения GFP. Теперь откройте вкладку «Параметры» и нажмите «Сделать фоновое изображение» После завершения операции нажмите на предварительный просмотр яркого изображения для измерения жизнеспособности A OPI. Смешайте 20 микролитров образца с 20 микролитрами A OPI и внесите пипетку в камеру для определения уровня инфицирования Candida albicans.

Хорошо перемешайте образец и отправьте его пипеткой прямо в счетную камеру. После того, как клетки осядут в камере, вставьте счетную камеру в цитометр для получения изображения. Сфокусируйтесь на образце, затем нажмите на счет.

Когда операция получения изображения будет завершена, снимите одноразовую счетную камеру и утилизируйте ее надлежащим образом. Для измерения A OPI результаты концентрации и жизнеспособности отображаются на странице результатов подсчета для определения уровня инфекции Candida albicans. После получения результатов подсчета нажмите на экспорт.

Затем отправьте данные в FCS express four для анализа популяции клеток GFP. В FCS express импортируйте файл данных и отобразите результаты на флуоресцентной гистограмме. Затем примените ворота клеточной популяции к гистограмме, чтобы определить процент популяции инфицированных клеток Candida albicans.

В этом эксперименте отслеживается рост клеток макрофагов, инфицированных дрожжами hcaps Lotum, в определенные моменты времени. Образцы окрашиваются и анализируются с помощью цитометрии на основе изображений. Высвобожденные дрожжевые клетки из шнурованных макрофагов идентифицируются с помощью программного обеспечения для зрения Сотера.

При этом абсолютное количество обнаруженных живых дрожжей больше, чем дрожжей, способных к образованию колоний на твердой среде. Эти данные подчеркивают наличие значительного количества жизнеспособных, но не поддающихся культивированию клеток. Эти макрофаги, полученные из костного мозга, были инфицированы дрожжевыми клетками C. albican, экспрессирующими зеленый флуоресцентный белок под контролем промотора A DH one.

Кратность инфекции в диапазоне от 0,1 до 10 приводила к постепенному увеличению интенсивности GFP в инфицированных макрофагах, а также общего процента инфицированных макрофагов после освоения. Этот метод может быть выполнен всего за несколько минут на образце, если он выполнен правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно не забывать устанавливать параметры таким образом, чтобы учитывались только грибковые клетки, а не клетки-хозяева.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать цитометрию изображения для количественного определения патогенных дрожжей в ассоциации с клетками хозяина. Не забывайте, что работа с патогенными грибами может быть крайне опасной, поэтому носите средства индивидуальной защиты и соблюдайте надлежащие процедуры утилизации биологически опасных отходов.