Без этикетки Количественные Протеомика Рабочий процесс для Discovery-Driven Хост-патоген взаимодействия

Здесь мы представляем протокол для профиля взаимодействия между хозяином и патогеном во время инфекции масс-спектрометрии на основе протеомии. В этом протоколе используется количественная оценка без меток для измерения изменений в изобилии белка как хозяина (например, макрофагов), так и патогена (например, неоформанов Cryptococcus)в одном эксперименте.

Наш протокол исследует грибковую инфекцию как с точки зрения хозяина, так и с точки зрения патогена, чтобы выявить взаимодействия между биологическими системами, которые имеют решающее значение для заболевания. Мы можем обнаружить как грибковые белки, так и белки хозяина в одном эксперименте и идентифицировать грибковые белки, вырабатываемые только во время инфекции, представляющие собой новые белки, ассоциированные с инфекцией. Несмотря на то, что мы уделяем основное внимание лечению грибковых инфекций, разрабатывая новые противовирулентные стратегии лечения, наш конвейер протеомики и биоинформатики универсален и может быть применен ко многим биологическим системам.

Наш подход закладывает основу для изучения различных патогенов и многочисленных иммунных реакций и может быть использован для получения нового понимания взаимосвязи между криптококком и врожденной иммунной системой. Реакция макрофагов на патогены и обнаружение достаточного количества грибковых белков важны. Поэтому рекомендуется тестирование и оптимизация MOI и временных точек для каждого вида.

Поскольку культивирование клеток макрофагов и грибков может быть сложной задачей, важно знать, чего ожидать после кокультуры. Визуализация дает исследователю уверенность в выполнении процедуры. Чтобы подготовить грибковые клетки к инфекции макрофагов, соберите и центрифугируйте клетки C neoformans из культуры средней длины фазы, после чего последует три щадящие промывки одним миллилитром PBS комнатной температуры в тех же условиях центрифуги.

После последней промывки ресуспендировать грибковые клетки в соотношении от 1,2 до 10-8 клеток на миллилитр культуры свободных клеток антибиотика средней концентрации и добавить по одному миллилитру суспензии грибковых клеток в каждую из четырех лунок с 70%-80% конфлюентной шестилуночной макрофагальной культуральной тарелкой. Затем поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на три часа. Осторожно наклоните пластину, чтобы каждую лунку можно было аккуратно промыть три раза одним миллилитром PBS на лунку за промывку.

Чтобы измерить уровень инфицирования после последней промывки, добавьте по одному миллилитру среды, не содержащей антибиотиков, в каждую лунку из шести лунок планшета и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур. В соответствующие экспериментальные моменты времени соберите надосадочную жидкость из каждой лунки и измерьте количество LDH в каждой лунке в соответствии со стандартными протоколами. Одновременно с этим следует лизировать неинфицированные клетки макрофагов для определения значения максимальной цитотоксичности.

Затем цитотоксичность может быть рассчитана с использованием указанной формулы. Для сбора неинфицированных макрофагов и совместного культивирования добавьте один миллилитр холодного PBS в каждую лунку с неинфицированными макрофагами. Через минуту осторожно постучите по пластине, чтобы отделить клетки от дна лунок и объединить клеточные суспензии в одну 15-миллилитровую пробирку.

Соберите ячейки центрифугированием и полностью удалите надосадочную жидкость, чтобы обеспечить немедленную мгновенную заморозку гранулы в жидком азоте при хранении при температуре минус 80 градусов. Анализ главных компонент процесса с наборами данных показывает, что, как и ожидалось, наибольшим компонентом разделения данных являются инфицированные и неинфицированные образцы. Второй отличительной чертой образцов является их биологическая изменчивость.

Сочетание корреляции Пирсона с иерархической кластеризацией по евклидову дистанции показывает четкую кластеризацию инфицированных и неинфицированных образцов с воспроизводимостью репликации в диапазоне от 95% до 96%Тест Стьюдента, скорректированный на проверку нескольких гипотез с использованием коэффициента ложных открытий Бенджамини-Хохберга, может быть выполнен для выявления белков со значительными различиями в распространенности во время инфекции по сравнению с неинфицированными контрольными группами. В этом анализе было идентифицировано 117 белков хозяина, демонстрирующих значительное изменение экспрессии при инфицировании. Примечательно, что также наблюдалось значительное увеличение обилия грибковых белков, как и ожидалось во время инфекции.

Важно бережно обращаться с макрофагами во время совместного выращивания, промывки и сбора образцов. Определяя, как патоген адаптируется к хозяину и как хозяин защищает себя от инфекции, можно получить новые знания в области микробиологии и иммунологии.