Без этикетки Количественные Протеомика Рабочий процесс для Discovery-Driven Хост-патоген взаимодействия
20 октября 2020 г.
Здесь мы представляем протокол для профиля взаимодействия между хозяином и патогеном во время инфекции масс-спектрометрии на основе протеомии. В этом протоколе используется количественная оценка без меток для измерения изменений в изобилии белка как хозяина (например, макрофагов), так и патогена (например, неоформанов Cryptococcus)в одном эксперименте.
Наш протокол исследует грибковую инфекцию как с точки зрения хозяина, так и с точки зрения патогена, чтобы выявить взаимодействия между биологическими системами, которые имеют решающее значение для заболевания. Мы можем обнаружить как грибковые белки, так и белки хозяина в одном эксперименте и идентифицировать грибковые белки, вырабатываемые только во время инфекции, представляющие собой новые белки, ассоциированные с инфекцией. Несмотря на то, что мы уделяем основное внимание лечению грибковых инфекций, разрабатывая новые противовирулентные стратегии лечения, наш конвейер протеомики и биоинформатики универсален и может быть применен ко многим биологическим системам.
Наш подход закладывает основу для изучения различных патогенов и многочисленных иммунных реакций и может быть использован для получения нового понимания взаимосвязи между криптококком и врожденной иммунной системой. Реакция макрофагов на патогены и обнаружение достаточного количества грибковых белков важны. Поэтому рекомендуется тестирование и оптимизация MOI и временных точек для каждого вида.
Поскольку культивирование клеток макрофагов и грибков может быть сложной задачей, важно знать, чего ожидать после кокультуры. Визуализация дает исследователю уверенность в выполнении процедуры. Чтобы подготовить грибковые клетки к инфекции макрофагов, соберите и центрифугируйте клетки C neoformans из культуры средней длины фазы, после чего последует три щадящие промывки одним миллилитром PBS комнатной температуры в тех же условиях центрифуги.
После последней промывки ресуспендировать грибковые клетки в соотношении от 1,2 до 10-8 клеток на миллилитр культуры свободных клеток антибиотика средней концентрации и добавить по одному миллилитру суспензии грибковых клеток в каждую из четырех лунок с 70%-80% конфлюентной шестилуночной макрофагальной культуральной тарелкой. Затем поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на три часа. Осторожно наклоните пластину, чтобы каждую лунку можно было аккуратно промыть три раза одним миллилитром PBS на лунку за промывку.
Чтобы измерить уровень инфицирования после последней промывки, добавьте по одному миллилитру среды, не содержащей антибиотиков, в каждую лунку из шести лунок планшета и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур. В соответствующие экспериментальные моменты времени соберите надосадочную жидкость из каждой лунки и измерьте количество LDH в каждой лунке в соответствии со стандартными протоколами. Одновременно с этим следует лизировать неинфицированные клетки макрофагов для определения значения максимальной цитотоксичности.
Затем цитотоксичность может быть рассчитана с использованием указанной формулы. Для сбора неинфицированных макрофагов и совместного культивирования добавьте один миллилитр холодного PBS в каждую лунку с неинфицированными макрофагами. Через минуту осторожно постучите по пластине, чтобы отделить клетки от дна лунок и объединить клеточные суспензии в одну 15-миллилитровую пробирку.
Соберите ячейки центрифугированием и полностью удалите надосадочную жидкость, чтобы обеспечить немедленную мгновенную заморозку гранулы в жидком азоте при хранении при температуре минус 80 градусов. Анализ главных компонент процесса с наборами данных показывает, что, как и ожидалось, наибольшим компонентом разделения данных являются инфицированные и неинфицированные образцы. Второй отличительной чертой образцов является их биологическая изменчивость.
Сочетание корреляции Пирсона с иерархической кластеризацией по евклидову дистанции показывает четкую кластеризацию инфицированных и неинфицированных образцов с воспроизводимостью репликации в диапазоне от 95% до 96%Тест Стьюдента, скорректированный на проверку нескольких гипотез с использованием коэффициента ложных открытий Бенджамини-Хохберга, может быть выполнен для выявления белков со значительными различиями в распространенности во время инфекции по сравнению с неинфицированными контрольными группами. В этом анализе было идентифицировано 117 белков хозяина, демонстрирующих значительное изменение экспрессии при инфицировании. Примечательно, что также наблюдалось значительное увеличение обилия грибковых белков, как и ожидалось во время инфекции.
Важно бережно обращаться с макрофагами во время совместного выращивания, промывки и сбора образцов. Определяя, как патоген адаптируется к хозяину и как хозяин защищает себя от инфекции, можно получить новые знания в области микробиологии и иммунологии.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе исследуется взаимодействие между хозяином и патогеном при грибковой инфекции с помощью протеомики на основе масс-спектрометрии. Этот метод позволяет обнаруживать белки как хозяина, так и патогена в одном эксперименте, что дает представление о белках, связанных с инфекционным процессом.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Инфекционные заболевания
- Протеомика
Теоретическое обоснование
- Понимание взаимодействий между хозяином и патогеном имеет решающее значение для исследования заболеваний.
- Грибковые инфекции представляют серьезную угрозу для здоровья, что обуславливает необходимость разработки новых стратегий лечения.
- Протеомика позволяет выявить изменения в содержании белков в процессе инфекции.
- Макрофаги играют ключевую роль в иммунном ответе на патогены.
Цель исследования
- Изучить взаимодействия между макрофагами хозяина и патогеном Cryptococcus neoformans.
- Идентифицировать новые белки, ассоциированные с инфекцией и синтезируемые в процессе грибкового заражения.
- Разработать универсальный протеомный и биоинформатический конвейер, применимый к различным биологическим системам.
Используемые методы
- Протеомика на основе масс-спектрометрии для детекции белков.
- Безметочная количественная оценка для измерения изменений содержания белков.
- Оптимизация множественности заражения (MOI) и временных точек для получения точных результатов.
- Биоинформатический анализ для интерпретации протеомных данных.
Основные результаты
- Идентификация грибковых белков, синтезируемых специфически в процессе инфекции.
- Получение данных о реакции макрофагов на Cryptococcus neoformans.
- Создание основы для изучения различных патогенов и иммунных ответов.
- Демонстрация применимости данного протокола к различным биологическим системам.
Выводы
- Данный протокол предлагает комплексный подход к изучению взаимодействий между хозяином и патогеном.
- Он закладывает основу для будущих исследований грибковых инфекций и иммунных ответов.
- Для различных видов рекомендуется дальнейшая оптимизация условий эксперимента.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный рабочий процесс количественной протеомики без использования меток позволяет проводить одновременное профилирование протеомов хозяина и патогена в процессе инфекции, предоставляя непредвзятые данные об обилии белков, которые имеют решающее значение для валидации мишеней в исследованиях инфекционных заболеваний. Посредством идентификации связанных с инфекцией грибковых белков и сигнатур ответа хозяина данный метод способствует механистическому снижению рисков при разработке антивирулентных стратегий и помогает в выборе мишеней для доклинических исследований. Возможность применения этого метода в различных системах «хозяин-патоген» расширяет возможности его использования в рамках портфеля программ по поиску противогрибковых и иммуномодулирующих средств.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем идентификации белков патогена, вырабатываемых исключительно во время инфекции, что открывает новые мишени, связанные с вирулентностью.
- Научная ценность: проясняет пути взаимодействия хозяина и патогена за счет корреляции изменений содержания белков в обоих протеомах, что способствует функциональной валидации мишеней.
- Научная ценность: снижает механистическую неопределенность, предоставляя количественные и воспроизводимые протеомные профили состояния инфекции для снижения рисков при проверке гипотез о мишенях.
Скрининг и разработка анализа
- Практическая ценность: Подготовка валидированных биологических систем (инфицированных макрофагов) для последующей разработки анализов со стандартизированными условиями инфицирования и оптимизацией MOI.
- Практическая ценность: Получение количественных безметочных протеомных данных, подходящих для стандартизации анализа и оценки воспроизводимости в ходе скрининговых кампаний.
- Практическая ценность: Возможность масштабируемого повторного использования платформы для различных патогенов благодаря универсальному дизайну протеомного и биоинформатического конвейера.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная ценность: выявление значимых для заболевания белков хозяина, реагирующих на микробную инвазию, что позволяет согласовать биомаркеры для доклинической валидации.
- Трансляционная ценность: обеспечение преемственности от этапа открытия до доклинических исследований путем установления связи между протеомными сдвигами при инфекции и патогенными механизмами.
- Трансляционная ценность: обоснование решений по продвижению проекта с учетом рисков за счет выделения белков, необходимых для вирулентности и механизмов защиты хозяина.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный рабочий процесс интегрируется в ранние этапы биологических исследований посредством профилирования взаимодействия хозяина и патогена, обеспечивает готовность к скринингу с помощью стандартизированных моделей инфекции и способствует трансляционным исследованиям, связывая протеомные изменения с механизмами вирулентности и иммунного ответа.
- Фундаментальная биология: Поддержка проверки гипотез и уточнения путей передачи сигналов путем количественной оценки изменений в протеомах патогена и хозяина, индуцированных инфекцией.
- Скрининг: Предоставление готовых к анализу биологических систем с оптимизированным MOI и временными точками, что обеспечивает воспроизводимость моделей инфекции для оценки соединений.
- Аналитика: Обеспечение безметочных количественных измерений и статистических данных (например, t-критериев с поправкой Бенджамини-Хохберга) для сравнения условий и идентификации значимо измененных белков.
- Трансляционные исследования: Установление связи между протеомными сигнатурами, механизмами патогенеза и ответами защитных систем хозяина, что способствует поиску биомаркеров и обеспечению непрерывности доклинических исследований.
- Корпоративное повторное использование: Создание многократно используемого конвейера протеомики и биоинформатики, применимого к различным патогенам и иммунным системам, что сокращает затраты на избыточную разработку методов.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность в валидации мишеней за счет непредвзятого количественного протеомного профилирования состояния инфекции.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию благодаря оптимизированным протоколам совместного культивирования, промывки и лизиса с валидированными метриками контроля качества (PCA, кластеризация, воспроизводимость репликатов 95-96%).
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), выявляя критические факторы вирулентности и сети ответа хозяина, что снижает биологические риски на поздних стадиях противогрибковых программ.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе экспрессии белков, специфичных для инфекции, и задействованных сигнальных путей.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы с культурами клеток млекопитающих и грибов, подготовки проб для протеомики и анализа данных масс-спектрометрии.
- Необходимо наличие доступа к оборудованию для LC-MS/MS, программному обеспечению для безметочного количественного анализа и биоинформатическим инструментам для PCA, кластеризации и анализа дифференциальной экспрессии.
- Требуется межкомандная стандартизация параметров инфекции (MOI, временные точки) и правил обращения с образцами для обеспечения воспроизводимости результатов в разных исследованиях.
- Предполагается адаптация метода для различных систем «патоген-хозяин», включая оптимизацию подготовки клеток грибов и плотности монослоя макрофагов.
- Практические ограничения включают техническую сложность детектирования низкокопийных белков грибов на фоне интенсивных сигналов белков хозяина, что требует достаточной степени инфицирования и высокой чувствительности метода.
