Без этикетки Количественные Протеомика Рабочий процесс для Discovery-Driven Хост-патоген взаимодействия
October 20th, 2020
Здесь мы представляем протокол для профиля взаимодействия между хозяином и патогеном во время инфекции масс-спектрометрии на основе протеомии. В этом протоколе используется количественная оценка без меток для измерения изменений в изобилии белка как хозяина (например, макрофагов), так и патогена (например, неоформанов Cryptococcus)в одном эксперименте.
Наш протокол исследует грибковую инфекцию как с точки зрения хозяина, так и с точки зрения патогена, чтобы выявить взаимодействия между биологическими системами, которые имеют решающее значение для заболевания. Мы можем обнаружить как грибковые белки, так и белки хозяина в одном эксперименте и идентифицировать грибковые белки, вырабатываемые только во время инфекции, представляющие собой новые белки, ассоциированные с инфекцией. Несмотря на то, что мы уделяем основное внимание лечению грибковых инфекций, разрабатывая новые противовирулентные стратегии лечения, наш конвейер протеомики и биоинформатики универсален и может быть применен ко многим биологическим системам.
Наш подход закладывает основу для изучения различных патогенов и многочисленных иммунных реакций и может быть использован для получения нового понимания взаимосвязи между криптококком и врожденной иммунной системой. Реакция макрофагов на патогены и обнаружение достаточного количества грибковых белков важны. Поэтому рекомендуется тестирование и оптимизация MOI и временных точек для каждого вида.
Поскольку культивирование клеток макрофагов и грибков может быть сложной задачей, важно знать, чего ожидать после кокультуры. Визуализация дает исследователю уверенность в выполнении процедуры. Чтобы подготовить грибковые клетки к инфекции макрофагов, соберите и центрифугируйте клетки C neoformans из культуры средней длины фазы, после чего последует три щадящие промывки одним миллилитром PBS комнатной температуры в тех же условиях центрифуги.
После последней промывки ресуспендировать грибковые клетки в соотношении от 1,2 до 10-8 клеток на миллилитр культуры свободных клеток антибиотика средней концентрации и добавить по одному миллилитру суспензии грибковых клеток в каждую из четырех лунок с 70%-80% конфлюентной шестилуночной макрофагальной культуральной тарелкой. Затем поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на три часа. Осторожно наклоните пластину, чтобы каждую лунку можно было аккуратно промыть три раза одним миллилитром PBS на лунку за промывку.
Чтобы измерить уровень инфицирования после последней промывки, добавьте по одному миллилитру среды, не содержащей антибиотиков, в каждую лунку из шести лунок планшета и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур. В соответствующие экспериментальные моменты времени соберите надосадочную жидкость из каждой лунки и измерьте количество LDH в каждой лунке в соответствии со стандартными протоколами. Одновременно с этим следует лизировать неинфицированные клетки макрофагов для определения значения максимальной цитотоксичности.
Затем цитотоксичность может быть рассчитана с использованием указанной формулы. Для сбора неинфицированных макрофагов и совместного культивирования добавьте один миллилитр холодного PBS в каждую лунку с неинфицированными макрофагами. Через минуту осторожно постучите по пластине, чтобы отделить клетки от дна лунок и объединить клеточные суспензии в одну 15-миллилитровую пробирку.
Соберите ячейки центрифугированием и полностью удалите надосадочную жидкость, чтобы обеспечить немедленную мгновенную заморозку гранулы в жидком азоте при хранении при температуре минус 80 градусов. Анализ главных компонент процесса с наборами данных показывает, что, как и ожидалось, наибольшим компонентом разделения данных являются инфицированные и неинфицированные образцы. Второй отличительной чертой образцов является их биологическая изменчивость.
Сочетание корреляции Пирсона с иерархической кластеризацией по евклидову дистанции показывает четкую кластеризацию инфицированных и неинфицированных образцов с воспроизводимостью репликации в диапазоне от 95% до 96%Тест Стьюдента, скорректированный на проверку нескольких гипотез с использованием коэффициента ложных открытий Бенджамини-Хохберга, может быть выполнен для выявления белков со значительными различиями в распространенности во время инфекции по сравнению с неинфицированными контрольными группами. В этом анализе было идентифицировано 117 белков хозяина, демонстрирующих значительное изменение экспрессии при инфицировании. Примечательно, что также наблюдалось значительное увеличение обилия грибковых белков, как и ожидалось во время инфекции.
Важно бережно обращаться с макрофагами во время совместного выращивания, промывки и сбора образцов. Определяя, как патоген адаптируется к хозяину и как хозяин защищает себя от инфекции, можно получить новые знания в области микробиологии и иммунологии.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот протокол исследует взаимодействие между хозяином и патогеном во время грибковой инфекции с использованием протеомики на основе масс-спектрометрии. Он позволяет выявлять как белки хозяина, так и патогена в одном эксперименте, предоставляя информацию о белках, связанных с инфекцией.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Инфекционные болезни
- Протеомика
Бакграунд
- Понимание взаимодействий хозяин-патоген важно для исследований заболеваний.
- Грибковые инфекции представляют значительные риски для здоровья, что требует новых стратегий лечения.
- Протеомика может показать изменения в изобилии белков во время инфекции.
- Макрофаги играют ключевую роль в иммунном ответе на патогены.
Цель исследования
- Исследовать взаимодействия между макрофагами хозяина и патогеном Cryptococcus neoformans.
- Идентифицировать новые белки, связанные с инфекцией, производимые во время грибковой инфекции.
- Создать универсальный протеомный и биоинформатический пайплайн, применимый к различным биологическим системам.
Используемые методы
- Протеомика на основе масс-спектрометрии для выявления белков.
- Безметочная квантификация для измерения изменений в изобилии белков.
- Оптимизация множественности инфекции (MOI) и временных моментов для получения точных результатов.
- Биоинформатический анализ для интерпретации протеомных данных.
Основные результаты
- Идентификация грибковых белков, специфически производимых во время инфекции.
- Понимание реакции макрофагов на Cryptococcus neoformans.
- Создание фреймворка для исследования различных патогенов и иммунных ответов.
- Демонстрация применимости протокола к различным биологическим системам.
Выводы
- Протокол предоставляет комплексный подход к исследованию взаимодействий хозяин-патоген.
- Он закладывает основу для будущих исследований грибковых инфекций и иммунных ответов.
- Рекомендуется дальнейшая оптимизация экспериментальных условий для разных видов.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This label-free quantitative proteomics workflow enables simultaneous profiling of host and pathogen proteomes during infection, providing unbiased protein abundance data critical for target validation in infectious disease research. By identifying infection-associated fungal proteins and host response signatures, the method supports mechanistic de-risking of anti-virulence strategies and informs preclinical target selection. Its transferability across host-pathogen systems enhances portfolio-wide applicability for antifungal and immunomodulatory discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying pathogen proteins exclusively produced during infection, representing novel virulence-associated targets.
- Scientific Value: Clarifies host-pathogen interaction pathways through correlated abundance changes in both proteomes, supporting functional target validation.
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing quantitative, reproducible infection-state proteomic profiles for de-risking target hypotheses.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Prepares validated biological systems (infected macrophages) for downstream assay development with standardized infection conditions and MOI optimization.
- Operational Value: Generates quantitative, label-free proteomic outputs suitable for assay standardization and reproducibility assessment in screening campaigns.
- Operational Value: Supports scalable platform reuse across diverse pathogens due to the universal proteomics and bioinformatics pipeline design.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Identifies disease-relevant host proteins responding to microbial invasion, enabling biomarker alignment for preclinical validation.
- Translational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical work by linking infection-state proteomic shifts to pathogenic mechanisms.
- Translational Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by highlighting proteins essential for virulence and host defense mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The workflow integrates into early discovery biology through host-pathogen interaction profiling, supports screening readiness via standardized infection models, and enables translational research by connecting proteomic changes to virulence and immune response mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying infection-induced changes in both pathogen and host proteomes.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with optimized MOI and time points, ensuring reproducible infection models for compound evaluation.
- Analytics: Provides label-free quantitative measurements and statistical outputs (e.g., Benjamini-Hochberg corrected t-tests) to compare conditions and identify significantly altered proteins.
- Translational Research: Links proteomic signatures to pathogenic mechanisms and host defense responses, supporting biomarker discovery and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable proteomics and bioinformatics pipeline applicable to multiple pathogens and immune systems, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through unbiased, quantitative infection-state proteomic profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via optimized coculture, washing, and lysis protocols with validated QC metrics (PCA, clustering, 95-96% replicate reproducibility).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing critical virulence factors and host response networks, reducing late-stage biological risk in antifungal programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on infection-specific protein expression and pathway involvement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian and fungal cell culture, proteomics sample preparation, and mass spectrometry data analysis.
- Dependent on access to LC-MS/MS instrumentation, label-free quantification software, and bioinformatics tools for PCA, clustering, and differential expression analysis.
- Necessitates cross-team standardization of infection parameters (MOI, time points) and sample handling to ensure reproducibility across studies.
- Involves adaptation considerations for different pathogen-host systems, including optimization of fungal cell preparation and macrophage confluency.
- Practical limitations include the technical challenge of detecting low-abundance fungal proteins amid high background host signals, requiring sufficient infection depth and sensitivity.
