Визуализация Candida Albicans в Желудочно-кишечном тракте Мурина с использованием флуоресцентных в ситу гибридизации

Целью этого протокола является визуализация формы клеток Candida Albicans и локализации в желудочно-кишечном тракте млекопитающих.

Этот протокол дал некоторые из лучших идей у нас есть до сих пор в том, как Candida Albicans обитает в желудочно-кишечном тракте млекопитающих. Например, до недавнего времени мы не знали, где Candida локализована в кишечнике или какие из его многочисленных морфологических форм он принимает в этой нише. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет визуализировать Candida в своей естественной среде, не нарушая трехмерных взаимодействий грибок с принимающими структурами или с бактериями в микробиоте.

Поскольку кишечник представляет собой сложную среду, очень трудно моделировать в лаборатории, и поэтому было очень приятно найти способ исследовать биологию Candida непосредственно в принимающей модели. Некоторые компоненты микрофлоры кишечника, включая Candida albicans, как подозреваются, играют роль в таких заболеваниях, как воспалительные заболевания кишечника. Этот метод потенциально может быть использован для диагностики присутствия конкретных микроорганизмов в образцах биопсии, полученных от пациентов.

Для достижения оптимальных результатов важно овладение техникой гаважа и способность вскрывать желудочно-кишечные сегменты без разрыва органов. Для начала, gavage каждого животного с расчетным объемом данного инокулума. Прикрепите автоклавную иглу для кормления животных к одному миллилитровому шприцу и заполните шприц одним объемом гаважа, чтобы удалить все пузырьки.

Поместите шприц на стерильную поверхность. Чтобы обезопасить животное, держите его у основания хвоста доминирующей рукой и сдвиньте недоминантную руку вверх по спине животного к свободной коже прямо за ушами. Соберите потертости плотно с большим и указательный пальцы.

Возьмите животное за потертости, перевернуть его и цикл маленький палец той же руки вокруг хвоста, чтобы обездвижить животное против ладони. Аккуратно удлините голову животного так, чтобы оно было в прямой линии с телом. Затем возьмите шприц с доминирующей рукой и держите его перпендикулярно животному с изогнутой иглой, указывающей вниз.

Используйте шарик иглы, чтобы аккуратно подключить внутренний угол рта и заранее иглы вдоль стороны рта к задней части горла, а затем переместить иглу в центр. После того, как шарик иглы находится в задней части горла животного, наклоните иглу так, чтобы она была параллельно линии тела животного и позволить ему плавно скользить вниз по горлу. Если игла не скользит плавно вниз горло, игла не может быть должным образом расположены и должны быть сняты, чтобы переместить и попробовать еще раз.

Плавно заранее иглы позволяет животному проглотить иглу, пока только несколько миллиметров остаются видимыми. Проверьте, что шарик иглы находится в желудке, осторожно продвигая поршень и если нет сопротивления, продолжайте доставлять инокулум. Медленно свямите иглу после того, как инокулум был введен и поместите животное в клетку.

Продолжайте наблюдение за животным в течение пяти-десяти минут на наличие признаков затрудненного дыхания или дистресса и убедитесь, что оно возобновляет нормальную активность вскоре после гаважа. Если тот же инокулум будет использоваться для следующего животного, очистить иглу с спиртом протрите. Если будет использоваться другой инокулум, замените иглу.

Используйте тупые щипцы, чтобы ущипнуть часть брюшной кожи и incise кожи и основной фасции вблизи основания таза с помощью ножниц. Расширить разрез в U-образной форме вдоль каждой стороны брюшной полости и до грудной клетки, а затем поднять кожу в сторону. Используйте тупые типсы, чтобы аккуратно извлечь cecum из брюшной полости с помощью ножниц, чтобы разорвать связи между cecum и тонкой и толстой кишки.

Поместите весь cecum в гистологии кассеты так, что он раскручивается и лежит плашмя. Поместите вторую пенную площадку сверху и закройте кассету. Затем поместите кассету в банку с винтовой крышкой, содержащую метамфетамин.

Акцизный участок толстой кишки, который содержит от одного до двух фекальных гранул и имеет длину меньше, чем у кассеты. Поместите ткань в кассету, удерживая ее плоской и раскручиваемой. Наложить его со второй пены площадку, закрыть кассету и поместить его в methacarn.

Для каждого раздела тонкой кишки, которые будут отобраны, акциз один-два сантиметра сегмента, которые содержат некоторые пищеварительный материал. Поместите ткань в кассету, наложить со второй пены площадку, закрыть кассету и положить его в methacarn. При выдохе желудка, разорвать соединения с пищеводом и тонкой кишки.

Поместите ткань в кассету и поместите кассету в methacarn. Оставьте кассеты в растворе methacarn при комнатной температуре, по крайней мере три часа, но менее двух недель. После фиксации снимите пенные прокладки и верните каждый неповрежденный участок ткани в кассету.

Затем мыть ткани дважды в течение 35 минут в 100%метанол, дважды в течение 25 минут в 100% этанола, и дважды в течение 20 минут в ксилене. Пэт кассеты сухой на бумажное полотенце и поместить их в предварительно расплавленный парафин воск в течение двух часов при температуре 70 градусов по Цельсию в духовке гибридизации. Затем удалить кассеты из воска, позволяют избыток воска слить и хранить их при комнатной температуре, пока они не встроены в восковые блоки.

Де-воск парафин встроенных гистологических разделов, вставив слайды в предварительно разогретой банке заполнены ксилена. Оставьте банку при 60 градусах по Цельсию в течение 10 минут, а затем отбросить ксилена мыть. Налейте свежий ксилен комнатной температуры в банку и повторите инкубацию.

Затем заполните банку 100%-ным этанолом и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. После инкубации снимите слайды с банки и высушите их воздухом. Чтобы испачкать C.albicans с рыбьим зондом, начните с рисования круга вокруг секции ткани с помощью Пэт Пен.

Пипетка 50 микролитров зонда, содержащего раствор гибридизации на фиксированной ткани и аккуратно распространять его с кончиком пипетки. Наложение жидкости с гибридизации coverslip убедившись, чтобы предотвратить пузырьки. Затем запечатать горки в водонепроницаемой камере гибридизации и инкубировать разделы в течение трех часов при температуре 50 градусов по Цельсию в духовке гибридизации в темноте.

После инкубации добавьте раствор для мытья в банку Coplin. Аккуратно снимите крышку со слайда с помощью типсов и поместите слайд в стиральный раствор. Обложка банку с алюминиевой фольгой и инкубировать его при 50 градусов по Цельсию в течение 20 минут.

Затем вымойте горки, сливая стиральный раствор и заправив банку PBS. Немедленно слить и пополнить свежим PBS повторяя процесс в общей сложности два моет. Wick прочь PBS с деликатной задачей протрите и круг кишечной ткани разделе с Пэт Пен.

Поместите слайды в непрозрачный пластиковый контейнер и добавьте 50 микролитров раствора окрашивания ядер муцина в секцию тканей. Накройте контейнер алюминиевой фольгой и инкубировать его при четырех градусах по Цельсию в течение 45 минут. После инкубации положите горки в банку Coplin и помойте их дважды с помощью PBS.

Нажмите прочь избыток PBS на бумажное полотенце, а затем фитиль от окончательных капель с тканью. Поместите одну каплю монтажной среды на каждом участке и наложить его стеклянной крышкой убедившись, чтобы предотвратить пузыри. Пусть монтаж среды распространения под всей крышкой.

Якорь крышки на месте с лаком для ногтей по углам и изображение слайдов с помощью флуоресцентного микроскопа. Этот протокол может быть использован для флуоресцентно этикетки C.albicans in vitro и в тканях хозяина. В пробирке распространяется гифа, круглые дрожжевые клетки, клетки кишечника, и непрозрачные клетки были зафиксированы, проницаемы, и отличается флуоресценцией и фазовой контрастной микроскопии.

Круглые дрожжи и высоко удлиненные гифы были изображены в толстом кишечнике мыши. Ткани хозяина были запятнаны с зондом C.albicans специфическим или зондом panfungal. C.albicans был помечен красным цветом, ядра клеток-хозяина синими, а слой слизи зеленым.

C.albicans был обнаружен в различных сегментах тракта Мурин GI в том числе регионов, непосредственно прилегающих к принимающей слизистой оболочки и более центральных областях кишечника люмена. Для ученых, которые ранее не выполнили технику гаважа, важно получить специальную подготовку, прежде чем пытаться этот метод. После окрашивания рыбы, иммунофторесцентные методы могут быть использованы для окрашивания дополнительных особенностей слизистой оболочки хозяина.

Это может позволить для характеристики повреждения тканей или иммунной реакции хозяина. Этот метод позволил нам охарактеризовать связь между грибковых клеток морфологии Candida Albicans мутантов и выживания в принимающей дальнейшее наше понимание Candida Albicans биологии, которые могут быть использованы при разработке терапии.