Микроскопический фенотипический анализ для количественной оценки внутриклеточных микобактерий, адаптированных для скрининга с высокой пропускной способностью/высоким содержанием

Общей целью данной процедуры является измерение влияния модуляторов фенотипа, таких как сайленсинг гена хозяина или влияние малых молекул на микобактерии туберкулеза, внутриклеточную репликацию. Это достигается путем предварительного диспенсирования малых молекул и 384-луночных планшетов или пересечения клеток с ирнкой и трансфектом в комплекс. Следующим шагом является заражение клеток зеленым флуоресцентным белком, экспрессирующим микобактерию туберкулеза или G-F-P-M-T-B, добавление клеток в лунки, содержащие небольшие молекулы, и инкубация микропланшета в течение пяти дней.

Для подхода РНК-интерференции добавьте клетки в лунки, содержащие трансфектационный комплекс РНК-интерференции. Инкубируйте микропланшет в течение трех дней, а затем заражайте клетки G-F-P-M-T-B, экспрессирующими микобактерии туберкулеза. После окрашивания клеток заключительным этапом является считывание показаний пластин с помощью автоматизированного конфокального микроскопа.

В конечном счете, автоматизированная флуоресцентная микроскопия с последующим анализом на основе изображений используется для измерения изменений внутриклеточного роста G-F-P-M-T-V. Основным преимуществом этой техники существующего метода, такого как колонообразующая охота, является то, что она экономит длительный инкубационный период и обеспечивает большую пропускную способность. Эту процедуру будут демонстрировать Кристоф Кеваль или SONG и три постдокторанта из моей исследовательской группы.

В протоколах скрининга библиотеки SI РНК и скрининга библиотеки соединений используются культуры GFP двухнедельной давности, экспрессирующие MYCOBACTERIUM tuberculosis H 37 RV. Для приготовления бактериальной суспензии G-F-P-M-T-B сначала центрифугируют культуру при давлении 4000 G в течение пяти минут, отбрасывают надосадочную жидкость Resus, суспендируют культуру в DPBS и снова центрифугируют таким образом. Трижды промойте культуру с помощью DPBS.

После третьей промывки выбросьте супернат и повторно суспендируйте бактериальную гранулу в 10 миллилитрах 10% FBS, содержащей среду RPMI 1640. Оставьте суспензию на один час при комнатной температуре, чтобы бактериальные агрегаты могли осеть. Соберите бактериальный супернат и измерьте OD на 600 нанометрах и флуоресценцию GFP.

Используя микропланшетный ридер для определения концентрации бактерий, внешний диаметр на 600 нанометрах должен составлять от 0,6 до 0,8. Рассчитайте титр суспензии с помощью опорной регрессионной линии, отображая значение RFU как функцию значения КОЕ, полученного до экспериментов на другой культуре, которая была приготовлена в тех же условиях. Типичная концентрация составляет от одного умножить на 10 до восьми бактерий на миллилитр.

Начните эту процедуру с приостановки Resus высушенной библиотеки SI РНК, которая хранится в 96. Ну и материнские пластины с одним X-S-I-R-N-A буфером до концентрации двух микромоляров. Перенесите 10 микролитров смеси в каждую лунку дочерней пластины на 384 лунку, перенесите 2,5 микролитра РНК SI из каждой лунки дочерней пластины в пробирную пластину 384 лунки на ту же пластину для анализа.

Добавьте по 2,5 микролитра отрицательного и положительного контроля IRNA в соответствующие лунки. Если дочерняя пластина не будет использоваться, немедленно загерметизируйте ее съемным алюминиевым уплотнителем. Герметичная пластина может храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия не менее шести месяцев и, возможно, до двух-трех лет в зависимости от IRNA.

Рекомендации производителя библиотеки. Приготовьте реагенты для трансфекции, разбавив его в одном X-D-P-B-S до получения достаточного количества раствора для получения 0,1 микролитра на каждый. Хорошо предварительно инкубируйте разведенный раствор трансфекции при комнатной температуре в течение пяти минут.

Добавить 7,5 мкл разведенного трансфекционного раствора в каждую лунку 384-луночной пробирной пластины и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре в каждую лунку пробирной пластины по 40 мкл человеческих пневмоцитов 2-го типа, А 5449 клеток, взвешенных в среде RPMI 1640 с добавлением 10%-ной фетальной бычьей сыворотки. Поддерживайте клетки в течение трехдневного инкубационного периода при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Эти клетки делятся каждые 24 часа, таким образом, около 12 000 клеток находятся в каждой лунке через три дня после трансфекции.

Через три дня после си. С помощью РНК-трансфекции 5 49 клеток получают бактериальную суспензию MTBH 37 RV GFP. Как было продемонстрировано ранее.

Суспензия должна содержать от 2,4 до 10 до шести бактерий на миллилитр, что соответствует кратности инфекции пяти. Удалите среду из аналитической пластины 384 лунки и добавьте 25 микролитров бактериальной суспензии на лунку. Инкубируйте планшет для анализа 384 лунок при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти часов в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа.

Через пять часов. Удалите среду и аккуратно промойте клетки три раза средой RPMI с добавлением 10% FBS, чтобы убить оставшиеся внеклеточные бактерии. Обработайте клетки в каждой лунке 50 микролитрами.

Свежая среда R-P-M-I-F-B-S, содержащая 50 микрограммов амикацина на миллилитр. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Наконец, удалите среду, содержащую амикацин, и добавьте 50 микролитров свежей среды RPMI с добавлением 10% FBS на каждую. Колодец.

Инкубируйте планшет для анализа при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти дней в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, перед скринингом с помощью конфокальной микроскопии. Чтобы начать эту процедуру, разморозьте материнскую пластину 384 лунки, содержащую библиотеку соединений, растворенную в 100% ДМСО при комнатной температуре, перенесите 0,5 микролитра соединений с материнской пластины на дочернюю пластину 384 лунки, содержащую 10 микролитров RPMI 1640 на лунку. Среда с добавлением 10% FPS следующего урожая шестидневных первичных макрофагов человека в четыре раза по 10 до пяти клеток на миллилитр в RPMI 1640.

Среда с добавлением 10% FPS и 50 нанограмм на миллилитр. Рекомбинантные человеческие MCSF инкубируют разведенные первичные клетки с базией при различных MOI в диапазоне от одного до пяти в суспензии с легким встряхиванием при 90 об/мин в течение двух часов при 37 градусах Цельсия. Промойте инфицированные клетки центрифугированием при давлении 350 GS в течение пяти минут, чтобы удалить внеклеточные бактерии.

Реактивная суспензия гранул в RPMI 1640. Среда с добавлением 10% FPS и центрифуги. Опять же, повторите это, постирайте два раза после окончательной стирки.

Резус суспендирует инфицированные клетки в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и 50 мкг на миллилитр. Амикацин инкубируют суспензию с легким встряхиванием в течение одного часа при 37 градусах Цельсия, центрифугой при 350 GS в течение пяти минут. Удалите среду, содержащую амикацин, и промойте инфицированные клетки полным RPMI 1640.

Среда дополнена 10% FBS и 50 нанограмм на миллилитр. Рекомбинантный человеческий MCSF. Повторите эту стирку один раз.

Добавьте 40 микролитров на лунку зараженной суспензии макрофагов в тот же 384 луночный испытательный планшет, приготовленный ранее, который уже содержит 10 микролитров разведений соединения. Конечная концентрация ДМСО в каждой лунке теперь составляет 1%.Инкубируйте анализируемые планшеты в течение пяти дней при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, перед скринингом с помощью конфокальной микроскопии на наличие библиотеки SI РНК. Скрининг перед получением изображения добавьте в каждую лунку планшета для анализа 10 микролитров свежеприготовленного 30 микрограммов на миллилитр DPI в PBS и инкубируйте в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия.

Для скрининга соединений Перед получением изображения окрашивайте живые клетки дальним красным флуоресцентным красителем в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Загрузите пластины для анализа в автоматический конфокальный микроскоп. Задайте параметры экспозиции, записывайте флуоресценцию DPI с помощью возбуждающего лазера на 405 нм с эмиссионным фильтром на 450 нм.

Запись флуоресценции GFP с помощью возбуждающего лазера на 488 нанометрах с эмиссионным фильтром на 520 нанометрах. Выберите скважины и месторождения на каждой скважине, которые будут обрабатываться, которые затем будут называться схемами и подпланами. Параметры генерируют файл экспериментов с заданными параметрами и запускают автоматический сбор данных.

В этом случае записываются четыре разных изображения одной и той же скважины и месторождения для передачи изображений на удаленный сервер. Впоследствии изображения оцениваются с помощью программного обеспечения для анализа изображений acapella 2.6 для скрининга SI РНК. Каждое поле содержит два канала или цвета.

Зеленый для бактерий и синий для клетки. Ядра обнаруживают ядра клеток из канала DAPI с помощью алгоритма обнаружения ядер и бактериальную область из канала GFP с помощью алгоритма свойств интенсивности пикселей. Путем объединения каналов и подсчета количества пикселей, общих для бактерий и клеток, внутриклеточные бактерии количественно оцениваются.

Окончательные результаты, выраженные в виде среднего значения по четырем полям, представляют собой общую бактериальную площадь, общее количество клеток, процент инфицированных клеток и бактериальную площадь на клетку. Для комплексного скрининга каждое поле содержит два канала или цвета: зеленый для бактерий и дальний красный для клетки. Ядра и цитоплазма обнаруживают область клеток из дальнего красного канала и бактериальную область из канала GFP с помощью алгоритма свойств интенсивности пикселей.

Путем объединения каналов и подсчета количества пикселей, общих для бактерий и ядер, внутриклеточные бактерии количественно оцениваются. Конечные результаты, выраженные в виде среднего значения по четырем полям, представляют собой общую бактериальную площадь, общую площадь клеток, общую площадь внутриклеточных бактерий и соотношение между площадью внутриклеточных бактерий и общей площадью клеток. Представлены репрезентативные результаты высокопроизводительного полногеномного скрининга SI РНК, подавление экспрессии din one с SI РНК привело к уменьшению количества внутриклеточных микобактерий в 5 49 клетках.

Как показано на этих репрезентативных конфокальных изображениях 5, 49 клеток, трансфицированных нецелевой IRNA или SI РНК, специфичной для din one, и инфицированных GFP, экспрессирующим MTB в течение пяти дней. GFP MT BH 37 RV был визуализирован зеленым цветом, а ячейки — красным. Количество клеток и внутриклеточная нагрузка G-F-P-M-T-B-H 37 RV определяли с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

На этом графике показан процент инфицированных 5 49 клеток в пяти повторах скремблированной IRNA, представленной синими кружками, и din one irna, представленной красными кружками. После трех дней молчания и пяти дней инфекции процент инфицированных клеток снижается вдвое при одной молчаливой 549 клетках по сравнению с клетками, трансфицированными нецелевым IRNA. Для определения Z-оценки была применена выборочная нормализация SI РНК, нацеленная на DIN One по сравнению со скремблом.

Средний Z-показатель около минус 15 был получен для СИ, целевого DIN. Три звездочки означают значение P меньше 0,0001. Эти результаты указывают на то, что DIN 1 может быть использован в качестве положительного контроля для si, скрининга для обнаружения других новых факторов хозяина, участвующих в колонизации MTB, и пневмоцитов, которые могут иметь тот же фенотип, что и при использовании dins IRNA в скрининге соединений с высоким содержанием ИНК.

Эффективность соединения в отношении внутриклеточного бактериального роста оценивали путем построения кривой реакции на дозу или DRC и нормализации к референсным положительным и отрицательным соединениям. В этом примере первичные макрофаги человека, инфицированные штаммом A GFP, экспрессирующим MTBH 37 RV, инкубировали с 1% ДМСО в качестве отрицательного контроля или с увеличением концентраций двух референтных соединений: isid, INH и рифампицина. РИФ. Макрофаги помечены красным флуоресцентным красителем, а зеленый цвет указывает на то, что анализ MTB конфокальных флуоресцентных изображений инфицированных макрофагов человека показал, что активные соединения влияют на внутриклеточную репликацию MTB в клетках-хозяевах, что приводит к снижению микобактериальной нагрузки, которая соответствует площади сигнала GFP в клетках.

Соотношение между внутриклеточной бактериальной площадью и общей площадью клеток было рассчитано, а затем построено в виде функции концентрации соединений для получения DRC, показанных здесь DRC isid и рифампицина на каждом графике. ДРК соединения нормализовали до 1% ДМСО, что является отрицательным контролем, и 0,1 мкг/миллилитр, что является положительным контролем. Эти кривые позволяют определить как концентрацию, необходимую для ингибирования 50% бактериальной колонизации, так и минимальную концентрацию, необходимую для ингибирования 99% бактериальной репликации в течение одного семестра.

Этот метод может быть выполнен за 10 часов, разделенных следующим образом: два часа на трансфекцию клеток или получение соединения, шесть часов на инфицирование клеток и дозирование в микропланшет и два часа на получение изображения. В течение восьми дней не забывайте, что работа с микобактериями туберкулеза может быть чрезвычайно высокой, как и при выполнении этой процедуры, всегда следует принимать преждевременные меры, такие как ношение средств индивидуальной защиты, включая маску.