Идентификация метаболически активных бактерий в кишечнике в Универсал Spodoptera littoralis Через ДНК стабильный изотоп Зондирование Использование ¹³ С-Глюкоза

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы подробно описать эффективную методологию, используемую для генетической характеристики метаболически активных бактерий в кишечнике насекомого. Это достигается путем введения насекомому меченой С-13 глюкозы для изотопного обогащения ДНК метаболически активных бактерий в кишечнике. Следующим шагом является извлечение ДНК бактериального сообщества, присутствующего в кишечнике.

Третий шаг заключается в выделении ДНК метаболически активных веществ, которые включали в себя C 13. Затем ДНК филогенетически идентифицируется и количественно оценивается для присутствующих видов с помощью пиросеквенирования. Таким образом, идентификация метаболически активных видов бактерий, составляющих сообщество, присутствующее в кишечнике насекомых.

Таким образом, кишечник многоклеточного организма является гениальным изобретением, использующим метаболические способности микроорганизмов для растворения или растворения сложных органических веществ, чтобы они могли в конечном итоге служить питательными веществами для насекомого-хозяина. Чтобы понять систему, мы должны проанализировать, во-первых, кто находится там, а во-вторых, у кого есть метаболическая активность. Если у нас есть эти данные, мы можем реконструировать поток метаболитов и продуктов распада между разлагающимися микроорганизмами и насекомым-хозяином.

Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы в области экологии микроорганизмов, в частности, о том, как эти микробы взаимодействуют со своим хозяином. В этом смысле мы могли бы узнать больше, прояснить и определить, какие функции эти организмы выполняют для своего хозяина. Хотя этот метод может дать представление об общих активных кишечных бактериях.

Отслеживая уровень глюкозы в UCLE, можно также выполнить его с другим источником углерода, например, пометить целлозу для идентификации активных бактерий, участвующих в процессе переваривания питательного вещества окранты. Поддерживайте оп литры, яйца и чашки Петри до тех пор, пока они не вылупятся. Затем перенесите только что вылупившихся личинок в чистый пластиковый ящик и выращивайте их на искусственной диете при температуре от 23 до 25 градусов Цельсия в режиме долгого дня с 16 часами освещения и восемью часами темноты, через несколько дней перенесите от девяти до 15 здоровых личинок второго возраста из ящика для выращивания в отдельные чашки Петри, содержащие свежую глюкозу С-13.

При искусственной диете с шипами, требуется не менее трех повторений по три личинки в каждой. Используйте искусственную диету, обеспечивающую такое же количество естественной глюкозы, как и естественный источник пищи, такой как хлопок, для питания контрольной группы. В течение следующих 24 часов.

Часто обновляйте искусственные диеты. Начните с переноса личинок с помощью мягких щипцов в бассейн с дистиллированной водой, чтобы удалить крупный мусор. Затем переложите в новую чистую посуду для обезболивания и уничтожения насекомых.

Положите их на лед, а затем снизьте температуру до минус пяти градусов по Цельсию в холодильнике. Затем продезинфицируйте мертвых насекомых 70% этанолом и погрузите их в PBS для вскрытия. Инструменты также должны быть очищены 70% этанолом.

Начните с разрезов кутикулы по правой и левой сторонам. Начните с головы и закончите на анальном отверстии. Удалите весь экзоскелет, малийские канальцы и жировое тело.

Затем замените буфер перед вскрытием кишечника кишечником, изолированным от других тканей. Обработайте всю кишку или участки для кишки, средней кишки или задней кишки. В зависимости от научного вопроса.

Переложите ткани кишечника без PBS в небольшую стерильную пробирку и храните их в морозильной камере. Перед экстракцией ДНК высушите образцы при температуре 45 градусов Цельсия в вакуумном концентраторе в течение 30–90 минут, в зависимости от размера ткани. Далее измельчите высушенную ткань с помощью стерильного пластика Pele, чтобы извлечь геномную ДНК с помощью набора для извлечения ДНК из почвы.

Затем определяют концентрацию окончательной ускользающей ДНК с помощью спектрофотометра. Подтвердите успешное извлечение микробной метагеномной ДНК из кишечника насекомых путем подготовки диагностического ПЦР-анализа с использованием бактериальных общих праймеров 27 F и 1, 492 R. Для постановки диагноза. Внесите по пять микролитров каждого продукта ПЦР на 1%-ный гель агрос при напряжении 300 вольт и 115 миллиамперах в течение примерно 20 минут.

Правильный размер ампликонов – 1,5 килобазы. Соберите извлеченную ДНК, соответствующую каждой экспериментальной реплике. Содержание тех, у кого есть и нет глюкозы C13, отдельно.

Нормализуйте концентрацию ДНК, чтобы убедиться, что каждый образец вносит равный вклад в свой пул. Конечная концентрация от 500 до 5000 нанограммов ДНК подходит для процесса ультрацентрифугирования. Дважды проверьте предполагаемую концентрацию с помощью спектрофотометра в стерильной пробирке с завинчивающейся крышкой объемом 15 миллилитров.

Установите градиентную среду. Объедините количественную ДНК с 4,8 миллилитрами раствора хлорида цезия. Затем долейте объем шестью миллилитрами градиентного буфера.

Осторожно переложите смеси в ультрацентрифужные пробирки объемом 5,1 миллилитров. С помощью шприца и иглы наполните трубки до основания горлышка и избегайте накачивания или образования пузырьков воздуха. Включайте хотя бы один пустой градиент без ДНК в каждый прогон.

Чтобы действовать как эталонный градиент, выберите пары пробирок и сбалансируйте их с точностью до 10 миллиграммов. Нанесите на каждую трубку верхушку и убедитесь, что они не протекают, перевернув трубку и приложив умеренное давление вручную. Используйте почти вертикальный ротор с восемью лунками.

Тщательно загерметизируйте лунки ротора и загрузите ротор в ультрацентрифугу в соответствии с инструкциями производителя. Раскрутите ДНК со скоростью 50 000 оборотов в минуту при температуре 20 градусов Цельсия в вакууме в течение 40 часов. Выберите максимальное ускорение и замедление без торможения.

Через два дня осторожно извлеките пробирки из ротора центрифуги с помощью щипцов. Поместите их в решетку, не нарушая образовавшихся градиентов и сразу же обработайте трубки. Сначала уравновесьте ВЭЖХ, используя скорость потока 850 микролитров в минуту.

Затем прикрепите ультрацентрифужную пробирку к зажимной стойке и проткните дно пробирки иглой 23 калибра в один дюйм, прикрепленной к шприцу. Поэтому осторожно проткните верхнюю часть трубки с помощью контрольного минера, чтобы не нарушить форму, градиент и предварительную практику, чтобы обеспечить успешное движение PSA. Затем вставьте иглу, прикрепленную к трубке насоса, в верхнюю часть трубки, где нет жидкости, и соберите капли снизу прямо в стерильные 1,5 миллилитровые микропробирки собирайте фракцию каждые 30 секунд по 425 микролитров на фракцию.

В этом примере из каждого градиента собирается 12 дробей. Далее измерьте плотность каждой отделенной фракции на аналитических весах. Продолжайте восстановление ДНК и пиросеквенирование, сверяясь с текстовым протоколом в течение 24 часов.

10 миллимоляров глюкозы С-13 добавляли в рацион ссоп литров. Личинка. Такое же количество нормальной глюкозы добавлялось в пищу контрольных насекомых. Затем была выделена ДНК из бактериального сообщества кишечника насекомых.

На геле для электрофореза сильная полоса геномной ДНК в верхней части подтвердила успешную экстракцию ДНК, диагностическую ПЦР. Использование бактериальных универсальных праймеров показало наличие бактериальной ДНК: количественное пиросеквенирование было проведено непосредственно на репрезентативных градиентах SIP для выявления видовой линии и их относительной численности. Всего было сгенерировано 120 045 высококачественных прочтений со средней длиной 404 OT.

Профиль пиросеквенирования показал повышенную численность некоторых видов, включая энтерококк и панто, в меченом образце по сравнению с контрольной группой. Таким образом, эти бактерии считаются метаболически активными и заслуживают дальнейшего изучения. Поэтому, пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости привлечения надлежащего контроля к анализу CYP.

Таким образом, что вычтет воздействие фона, загрязнение в волосяной вспышке и гарантирует, что разнообразие и изобилие бактерий, появляющихся или исчезающих, не являются артефактами самой массы. Следуя этой процедуре или таким методологиям, как флуоресцентная гибридизация in situ, можно использовать и выполнять для ответа на дополнительные вопросы. В этом случае будет следствовать локализация и расположение бактерий внутри кишечника насекомого.