Систематический анализ Экстракорпоральное Сотовый Роллинг Использование нескольких хорошо Plate микрофлюидных системы

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы провести исследования по скручиванию клеток с повышенной пропускной способностью при строго контролируемом, физиологически значимом сдвиговом потоке. Это достигается с помощью многоскважинной микрофлюидной системы, в которой соседние скважины в специализированной пластине соединены микрофлюидным каналом. Интерфейс системы соединяет электропневматический насос с верхней частью многолуночной пластины и создает пневматическое давление, которое направляет жидкость изнутри скважин через микрофлюидные каналы с определенной скоростью потока.

После того, как микрофлюидный канал покрыт желаемой подложкой или монослоем клетки, представляющие интерес клетки вводят в микрофлюидный канал для исследования их специфических взаимодействий с поверхностью с покрытием, после чего свойства катания клеток при их взаимодействии с подложкой или поверхностью с покрытием монослоя в различных экспериментальных условиях могут быть проанализированы с помощью соответствующего программного обеспечения. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как проточная камера с параллельными пластинами, заключается в том, что он позволяет изучать свойства прокатки серебра со значительно более высокой производительностью при точно контролируемом, физиологически значимом потоке в трубке при минимизации расхода реагентов и клеток. Эта платформа может помочь в продвижении экзогенной клеточной терапии, позволяя быстро и точно анализировать инженерные подходы, предназначенные для воздействия на скручивание и самонаведение клеток.

Чтобы покрыть микрофлюидный канал белковым субстратом, сначала добавьте от 25 до 50 микролитров свежеприготовленного белкового раствора во входное отверстие. Что ж, затем приложите чистое усилие два обеда на квадратный сантиметр в течение пяти минут, чтобы раствор пролился в канал. Когда в выходном отверстии станет видна капелька жидкости, хорошо остановите поток, инкубируйте пластину в течение соответствующего количества времени с интересующим белком, а затем отсасывайте раствор из каждого. Колодец.

Затем добавьте от 200 до 500 микролитров PBS в выходное отверстие, а затем примените отвесный поток два дина на квадратный сантиметр в течение пяти минут, чтобы промыть канал и создать монослой клеток внутри микрофлюидного канала. Начните с осторожного трипсина в интересующие клетки из чашки для культивирования в течение трех минут, остановите реакцию с помощью двукратного объема полной среды, а затем центрифугируйте клетки в течение пяти минут при 400 G и rt. Далее промойте гранулу в 10 миллилитрах полного фильтрующего материала.

Затем повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре свежей полной среды и подсчитайте их, отрегулируйте клеточный раствор до соответствующей концентрации, а затем внесите от 25 до 50 микролитров клеточной суспензии в каждое входное отверстие. Теперь поместите планшет на предметный столик для микроскопа и примените прозрачный поток в два дина на квадратный сантиметр, чтобы потоки клеток подавались в канал до тех пор, пока не станет наблюдаться, что клетки заполняют весь канал. После остановки потока заполните как выходные, так и внутренние лунки 200 микролитрами соответствующей клеточной среды, а затем дайте ячейкам отстояться и прилипнуть при температуре 37 градусов Цельсия в 5% CO2.

Через три часа промойте канал полным носителем, чтобы удалить неприкрепленные ячейки. Теперь клетки должны быть полностью слиты и готовы к использованию для индуцирования воспалительной активации эндотелиальных клеток в каналах. Добавьте 100 микролитров свежеприготовленного раствора TNF alpha во входную лунку, а затем введите раствор в канал, применяя отвесный поток два дина на квадратный сантиметр в течение пяти минут.

Для контроля неактивированных каналов эндотелиальных клеток добавьте во входное отверстие 100 микролитров базальной среды эндотелиальных клеток. Ну а чтобы заблокировать селектин Р или Е на поверхности эндотелиальных клеток, введите в канал пять микрограммов на миллилитр соответствующего нейтрализующего антитела и инкубируйте планшет в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. Затем промойте каналы прикорневой средой перед началом прокатного пробы.

Внимательно осмотрите каналы под микроскопом, чтобы убедиться в правильности покрытия каналов. Затем промыть клеточную суспензию HL 60 базальными средами два раза после второго подсчета промывки, а затем повторно суспендировать клетки в IMDM в дозе пять раз по 10 до шестой концентрации клеток на миллилитр. После добавления от 25 до 50 микролитров клеточной суспензии в розетку, хорошо поместите пластину в держатель пластин с регулируемой температурой 37 градусов Цельсия и поместите держатель пластины на предметный столик для микроскопа.

Введите клетки в микрофлюидный канал. Они должны наблюдаться в течение 10-15 секунд при переходе от выхода к входу. Здесь можно наблюдать флуоресцентно помеченные ячейки HL 60, взаимодействующие с закодированной поверхностью P select, отображающие реакцию качения для изучения реакции качения в зависимости от напряжения сдвига, уменьшения сдвига до 0,25 динов на квадратный сантиметр и получения от 20 до 32-х видео с использованием функции захвата потока в каждом желаемом сдвиге. и постепенно увеличивая сдвиг с 0,25 до пяти динов на квадратный сантиметр.

Наконец, используйте ПЗС-камеру для получения видео анализа с потоком 11 кадров в секунду. Например, здесь показана ячейка HL 60, катающаяся по монослою клеток Чопа. Анализируйте траектории качения и скорости с помощью соответствующего совместимого программного обеспечения.

Ячейки HL 60 считаются золотым стандартом роликов, поскольку они экспрессируют различные самонаводящие лиганды, включая прокатные лиганды, P select и гликопротеиновый лиганд one, а также CI Lewis X.To проверки возможностей многолуночной микрофлюидной системы, многочисленные микрофлюидные каналы были покрыты одновременно различными субстратами и вращающимися взаимодействиями клеток HL 60. При анализе этих субстратов клетки продемонстрировали устойчивое перекатывание на поверхности, кодированной P select, при этом клетки сначала захватывались из потока, за которыми следовало отчетливое движение перекатывания. Как показано на этом графике и в соответствии с литературными данными, ячейки HL 60 демонстрируют сходное поведение при перекатывании на поверхностях селектина e и p, но не на подложках с покрытием FiberInc.

Скорость клетки, проанализированная с помощью совместимого программного обеспечения, была построена в зависимости от чистого напряжения, показывающего устойчивую реакцию клеток на p и e селектин со средней скоростью от одного до 12 микрон в секунду. Для оценки возможности использования этой микрофлюидной системы в эффективном тестировании взаимодействий между представляющими интерес клетками и однослойным покрытием поверхности CHO P-клеток, которые были трансфицированы для стабильной экспрессии P, но не e-селектина, были использованы, как показано здесь. Ячейки HL 60 демонстрируют значительную реакцию на качение на монослое CHO P-ячейки, чтобы проверить, действительно ли движение качения HL 60 опосредовано пектином.

Монослой предварительно инкубировали с блокирующими антителами к селектину P или E до поступления клеток HL 60 в канал. Как показано на этом графике, блокирование монослоя CHO p антителом P селектина привело к значительному уменьшению количества клеток HL 60, катающихся по поверхности, что свидетельствует о том, что P селектив и действительно опосредует катание HL 60. Как было описано ранее, многолуночная микрофлюидная пластина состоит из множества отдельных микрофлюидных каналов, что позволяет проводить испытания с более высокой пропускной способностью в различных условиях.

Эта выгодная конструкция была использована для пластинирования эндотелиальных клеток внутри микрофлюидных каналов для экспресс-анализа взаимодействий между клетками HL 60 и эндотелиальными клетками в различных экспериментальных условиях для моделирования воспалительных состояний эндотелиальные клетки были предварительно обработаны провоспалительным цитокином TNF альфа, что привело к повышению регуляции E, но не P-селектина на поверхности эндотелиальных клеток. Интересно, что клетки HL 60 не взаимодействовали с инактивированными эндотелиальными клетками, и не наблюдалось, чтобы клетки катались по этой поверхности. Напротив, клетки HL 60 продемонстрировали устойчивые вращающиеся свойства на эндотелиальных клетках, активированных TNF альфа, со средней скоростью от 5 до 15 микрон в секунду, чтобы исследовать участие селектина p или E во взаимодействиях между клетками HL 60 и активированными эндотелиальными клетками.

Эндотелиальные клетки, активированные ФНО альфа, предварительно инкубировали с селекцией P или E в блокирующих антителах, и катание клеток HL 60 анализировали, как показано на выбранном графике блокирование на эндотелиальных клетках ФНО альфа, приводило к значительному уменьшению количества катящихся клеток на активированном эндотелиальном монослое. Напротив, использование изотопного контроля или антитела против пектина, который не экспрессируется на активированных эндотелиальных клетках, не оказывало существенного влияния на прокатывание HL 60 на активированном эндотелиальном слое. Эти данные демонстрируют прямое участие селектина S в распространении HL 60 на эндотелиальных клетках, активированных TNF альфа, что согласуется с предыдущими сообщениями.

Аналитическое программное обеспечение позволяет отслеживать траектории отдельных клеток по мере их взаимодействия с поверхностью. Таким образом, пути отдельных клеток при их взаимодействии с эндотелиальными клетками, активированными TNF альфа, с или без выбора e и блокировки антител, были специально отслежены. Кроме того, оказалось, что вращательное движение клеток HL 60 на незаблокированных эндотелиальных клетках было непрерывным и устойчивым, в то время как катящиеся пути клеток на избранных и заблокированных эндотелиальных клетках были фрагментированы.

В соответствии с этим результатом, скорость перекатывания клеток HL 60 на незаблокированных эндотелиальных клетках TNF-альфа была значительно ниже, чем скорость перекатывания на селективных и заблокированных эндотелиальных клетках. Это исследование демонстрирует использование множественной микрофлюидной системы для эффективного проведения экспериментов по перекатке клеток с увеличенной производительностью до 10 прокатных газов в час при жестко контролируемом потоке трубки. В целом, эта микрофлюидная система представляет собой мощный метод для изучения скручивания клеток, что является ключевым аспектом клеточного хоинга.

Например, наша лаборатория в настоящее время использует эту систему для скрининга состояний, улучшающих хоуминг мезенхимальных стволовых клеток в качестве стратегии для улучшения их терапевтического эффекта.