Улучшенная способ получения человеческой клетки на основе, Связаться Модель гематоэнцефалического барьера

Эта процедура направлена на моделирование гематоэнцефалического барьера in vitro путем совместного культивирования астроцитов и эндотелиальных клеток на противоположных сторонах пористой мембраны. Сначала покройте просветную поверхность пористой мембраны внеклеточным матриксом. К белку, подобному коллагену, подходит перевернутая вставка с внешней силиконовой трубкой и внутренней силиконовой пробкой для создания съемного колодца над аблюминальной поверхностью мембраны.

Теперь засейте клетки астроцитов на инвертированной вставке так, чтобы они прилипли к поверхности алюмина. Затем снимите трубку и поместите вставку в нормальном положении в лунку со средним заполнением. Затем засейте эндотелиальные клетки в просветный компартмент вкладыша и сокультивируйте с противоположными астроцитами.

В конечном счете, прохождение флуоресцентных индикаторов или регистрация трансэндотелиального электрического сопротивления используется для измерения изменений проницаемости ГЭБ in vitro в ответ на различные стимулирующие агенты. Демонстрировать эту процедуру будет г-н Барри Ниго, постдок в моей лаборатории, который во время работы над докторской диссертацией разработал модифицированный протокол посева, который мы использовали для моделирования гематоэнцефалического барьера. Идея этой процедуры пришла нам в голову после того, как мы опробовали более грубые методы посадки и были разочарованы утечкой среды через паузу, а также небольших средних объемов.

Это диктовало короткие и недостаточные периоды сидения астроцитов, с чем мы и пытаемся бороться в нашей методике. Поместите вкладыши для культуры тканей в лунки 24-луночного планшета. Затем добавьте 50 микролитров 132 микрограмма на миллилитр крысиного коллагена, один для покрытия просветной поверхности вкладышей, инкубируйте в течение ночи во влажном инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия, чтобы удалить остатки кислоты, промойте обе алюминальные и просветные стороны вкладышей двойной дистиллированной водой.

Затем переверните вставки и аккуратно прикрепите короткий кусок эластичной силиконовой трубки вокруг края пористой мембраны. По сути создается новый колодец над алюминальной поверхностью. Для герметизации нижней стороны.

Подготовьте пробку из силиконовой трубки, запаянной с одного конца срезанным кончиком ПЦР-пробирки объемом 0,2 миллилитров. Теперь с помощью стерильного щипца вставьте силиконовую пробку в просветную полость и продвигайте ее, пока она не достигнет примерно одного-двух миллиметров от мембраны. Далее затравите 40 000 астроцитов в 200 микролитрах их поддерживающей среды непосредственно в силиконовый колодец над поверхностью алюминальной мембраны.

Для контроля адгезии астроцитов используйте стандартный 96-луночный планшет, так как он имеет ту же площадь поверхности, что и 6,5-миллиметровая вставка. Более легкая визуализация клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии затравки, идентичного объема суспензии астроцитарных клеток в 96 лунки восьмилуночной пластины. Это будет контролироваться с течением времени, чтобы определить, когда астроциты в лунке 96 и, соответственно, в мембране вкладыша достаточно прилипли для поддержания стерильности.

Транспортируйте собранные вставки между двумя шестилуночными планшетами, чтобы свести к минимуму воздействие нефильтрованного воздуха. Поместите клетки в инкубатор, чтобы дать возможность астроцитам прилипнуть. Также поместите контрольную пластину 96 Well в инкубатор в это время.

Примерно через четыре часа хорошо проверьте контрольную 96, чтобы увидеть, прилипли ли астроциты. Если это так, то перенесите вставной узел обратно в колпак для культуры тканей. Аккуратно снимите внешнюю силиконовую трубку и заглушки.

Затем верните вставки в нормальное вертикальное положение в лунки, содержащие 800 микролитров на лунку среды для поддержания эндотелиальных клеток. Наблюдайте за 20 000 эндотелиальных клеток мозга в 200 микролитрах на покрытой коллагеном поверхности люминальной поверхности в течение трех дней в среде БЭК без какой-либо смены среды. Перед экспериментами.

Промойте силиконовые трубки и пробки в этаноле перед автоклавированием для последующего использования. Чтобы стимулировать мозговой барьер крови in vitro, сначала замените абуминальную и люминальную среды 600 микролитрами и 100 микролитрами свободной сыворотки среды соответственно. Аспирируйте промывку просвета и замените 100 микролитрами сыворотки свободной среды, содержащей стимулирующие вещества.

Если вы индуцируете ГЭБ in vitro из астроцитарного компартмента, то аспирируйте алюминальную среду и замените 600 микролитрами сыворотки без нее. Среда, содержащая стимулирующие агенты, продолжается стандартными анализами парацеллюлярной или трансцеллюлярной проницаемости маркеров с целью создания модели контактного гематоэнцефалического барьера человека. Человеческие иммортализированные, астроциты и эндотелиальные клетки мозга культивируются на трехмикронных пористых мембранах, которые обеспечивают прохождение астроцитов и ног для контакта с эндотелиальными клетками.

Метод позволил обеспечить оптимальный непрерывный период посева астроцитов и беков, которые, в свою очередь, прочно прикрепляются к пористой поверхности с минимальной потерей клеток и увеличиваются до равномерного зарастания к трем дням. После посева. Оба типа клеток сохраняют свои клеточные специфичные маркеры на пористых мембранах, о чем свидетельствуют паттерны экспрессии глиального фибриллярного кислого белка GFAP в SVG и фактора фон Ванда VWF NEC.

В соответствии с наиболее фундаментальной особенностью контактной модели BBB, астроцитарная NFE может проходить через трехмикронные поры в просветный компартмент. Таким образом, потенциально может существовать контакт между SVG и BES, сидящими в порах этого размера. Кроме того, СЭМ-визуализация указывает на то, что SVG и BBC способны расти непосредственно над порами мембраны, что искусственно способствует физической барьерной функции контактных моделей ГЭБ in vitro.

В данном исследовании для изучения влияния фибринолитического агента TPAA на ГЭБ используется модель контакта человека с ГЭБ. Эти исследования in vitro подтверждают, что ТПА действительно увеличивает проницаемость интактного ГЭБ в концентрации и в зависимости от времени, которые находились в фармакологическом диапазоне. Драматические морфологические изменения астроцитов SVG очевидны на пористых мембранах после воздействия ТПА, что позволяет предположить, что астроцитарный ответ на ТПА лежит в основе индуцированного ТПА открытия ГЭБ.

Этот метод сыграл ключевую роль в нашем исследовании, целью которого было выяснить, как гематоэнцефалический барьер реагирует на тромболитический препарат ТПАА, используемый у пациента с инсультом для растворения тромбов. Это первая демонстрация этого метода в литературе, и мы надеемся, что другие исследователи смогут использовать его в своих целях.