Улучшенная способ получения человеческой клетки на основе, Связаться Модель гематоэнцефалического барьера

Данная процедура направлена на имитацию гематоэнцефалического барьера in vitro путем совместного культивирования астроцитов и эндотелиальных клеток по разные стороны пористой мембраны. Сначала покройте люминальную поверхность пористой мембраны внеклеточным матриксом. Белки, такие как коллаген, подходят для этого. Оснастите инвертированный вкладыш внешней силиконовой трубкой и внутренним силиконовым пробкой, чтобы создать съемную лунку над аблюминальной поверхностью мембраны.

Теперь посейте клетки астроцитов на перевернутый вкладыш так, чтобы они прикрепились к аблюминальной поверхности. Затем удалите трубку и поместите вкладыш в обычном положении в лунку, заполненную средой. Далее посейте эндотелиальные клетки в люминальный отдел вкладыша для совместного культивирования с астроцитами, расположенными с противоположной стороны.

В конечном итоге для измерения изменений проницаемости ГЭБ in vitro в ответ на воздействие различных стимулирующих агентов используется прохождение флуоресцентных трейсеров или запись трансэндотелиального электрического сопротивления. Эту процедуру продемонстрирует г-н Барри Ниго, постдок в моей лаборатории, который в ходе своей докторской диссертации разработал этот модифицированный протокол посева, который мы использовали для моделирования гематоэнцефалического барьера. Идея этой процедуры возникла у нас после тестирования более грубых методов посева, которые вызывали значительные трудности из-за утечки среды через поры, а также из-за малых объемов среды.

Это приводило к коротким и недостаточным периодам прикрепления астроцитов, что мы стремимся устранить в нашей методике. Поместите вставки для культивирования тканей в лунки 24-луночного планшета. Затем добавьте 50 µL коллагена крысы I типа в концентрации 132 µg/mL для покрытия люминальной поверхности вставок, инкубируйте в течение ночи в увлажненном инкубаторе при 37 °C для удаления остатков кислоты, после чего промойте аблюминальную и люминальную стороны вставок дважды дистиллированной водой.

Затем переверните вставки и аккуратно наденьте короткий отрезок эластичной силиконовой трубки на край пористой мембраны. Таким образом создается новая лунка над аблуминальной поверхностью для обеспечения герметичности нижней части.

Приготовьте пробку из силиконовой трубки, один конец которой герметично закрыт обрезанным кончиком ПЦР-пробирки объемом 0.2 milliliter. Затем с помощью стерильного пинцета вставьте силиконовую пробку в просвет полости и продвигайте её до тех пор, пока она не окажется на расстоянии примерно одного-двух миллиметров от мембраны. Далее посейте 40, 000 астроцитов в 200 microliters поддерживающей среды непосредственно в силиконовую лунку над аблюминальной поверхностью мембраны.

Для мониторинга состояния адгезии астроцитов используйте стандартный 96-луночный планшет, так как он имеет такую же площадь поверхности, как и вставка диаметром 6,5 мм, и обеспечивает более удобную визуализацию клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии. Внесите идентичный объем суспензии астроцитов в восемь лунок 96-луночного планшета. Состояние клеток будет контролироваться в течение определенного времени, чтобы определить момент, когда астроциты в лунках планшета и, соответственно, на мембране вставки достаточно адгезировали для обеспечения стерильности.

Перенесите собранные вставки, поместив их между двумя 6-луночными планшетами, чтобы минимизировать воздействие нефильтрованного воздуха. Поместите клетки в инкубатор для адгезии астроцитов. Также в это время поместите в инкубатор контрольный 96-луночный планшет.

Примерно через четыре часа проверьте контрольную лунку планшета на 96 лунок, чтобы убедиться, что астроциты прикрепились. Если это произошло, перенесите сборку с вставкой обратно в ламинарный шкаф для культивирования тканей. Осторожно удалите внешние силиконовые трубки и заглушки.

Затем верните вставки в обычное вертикальное положение в лунки, содержащие по 800 µL поддерживающей среды для эндотелиальных клеток в каждой лунке. Высейте 20 000 клеток эндотелия головного мозга в 200 µL на коллаген-покрытую люминальную поверхность; культивируйте совместно в течение трех дней в среде для BEC без смены среды. Перед началом эксперимента.

Промойте силиконовые трубки и пробки в этаноле перед автоклавированием для последующего использования. Чтобы стимулировать гематоэнцефалический барьер in vitro, сначала замените аблуминальную и люминальную среды на 600 µL и 100 µL бессывороточной среды BECS соответственно. Отсосите люминальную промывочную жидкость и замените ее 100 µL бессывороточной среды, содержащей стимулирующие агенты.

Если индукция ГЭБ in vitro осуществляется из астроцитарного компартмента, аспирируйте аблюминальную среду и замените ее на 600 µL безсывороточной среды, содержащей стимулирующие агенты; затем приступайте к стандартным анализам парацеллюлярной или трансцеллюлярной проницаемости с использованием меченых трейсеров для создания модели человеческого контактного гематоэнцефалического барьера. Иммортализованные астроциты и эндотелиальные клетки мозга человека культивируются на пористых мембранах с размером пор 3 µm, которые позволяют отросткам астроцитов проходить сквозь них для установления контакта с эндотелиальными клетками.

Данный метод обеспечил оптимальный период непрерывного посева астроцитов и эндотелиальных клеток мозга (becs), которые, в свою очередь, прочно прикрепляются к пористой поверхности с минимальной потерей клеток и достигают совместной конфлюэнтности к третьему дню после посева. Оба типа клеток сохраняют свои специфические маркеры на пористых мембранах, что подтверждается паттернами экспрессии глиального фибриллярного кислого белка GFAP в SVGs и фактора фон Виллебранда VWF в NECs.

В соответствии с наиболее фундаментальной особенностью контактной модели ГЭБ, астроцитарный NFE может проходить через поры размером три микрона в люминальный отдел. Таким образом, между SVGs и BES, расположенными на порах такого размера, потенциально может возникнуть контакт. Кроме того, данные СЭМ-визуализации указывают на то, что SVGs и BBCs были способны расти непосредственно поверх пор мембраны — явление, которое искусственно усиливает функцию физического барьера в контактных моделях ГЭБ in vitro.

В данном исследовании используется модель ГЭБ контактного типа с участием человеческих клеток для изучения влияния фибринолитического агента TPA на ГЭБ. Эти исследования in vitro подтверждают, что TPA действительно увеличивал проницаемость интактного ГЭБ концентрационно- и времязависимым образом, причем оба параметра находились в фармакологически значимом диапазоне. После воздействия TPA на пористых мембранах наблюдаются выраженные морфологические изменения астроцитов SVG, что позволяет предположить, что в основе вызванного TPA открытия ГЭБ лежит ответ астроцитов на данный агент.

Этот метод сыграл ключевую роль в нашем исследовании, целью которого было изучение реакции гематоэнцефалического барьера на тромболитический препарат TPAA, применяемый при лечении инсульта для растворения кровяных сгустков. Это первое описание данного метода в литературе, и мы надеемся, что другие исследователи смогут использовать его в своих целях.