Сосудистом сплетении эпителиальных клеток на основе модели крови человека-спинномозговой жидкости барьер для изучения бактериальной инфекции от базолатеральной стороны

Общая цель этого метода заключается в создании модели эпителиальных клеток сосудистого сплетения барьера крови и спинномозговой жидкости человека. Возможность изучения бактериальных инфекций с базально-латеральной стороны. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы об инфекционных заболеваниях центральной нервной системы, например, какие процессы участвуют при взаимодействии бактерий с эпителием сосудистого сплетения.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет анализировать взаимодействия патогенов с базальной латеральной черной стороной эпителиальных клеток. Этот метод также может быть применен в других исследованиях, таких как изучение трансмиграции иммунных клеток и опухолевых клеток через эпителий сосудистого сплетения. Впервые мне пришла в голову идея использовать для этого метода папиллому хоркоидного сплетения человека, или клетки HIBCCP, когда я прочитал рукопись Сибаты et.al 2005 года.

описание клеточной линии. Начните с использования стерильных щипцов, чтобы поместить фильтрующие вставки для клеточных культур площадью 0,33 сантиметра с перевернутыми порами размером три микрона в отдельные лунки двенадцатилуночного планшета. Затем с помощью серологической пипетки наполните лунку примерно тремя миллилитрами предварительно подогретой среды, отсасывая любой лишний раствор, пока нижний отсек не будет просто заполнен.

Далее добавьте 100 микрометров субкультуры 37 градуса с добавлением десяти процентов FCS поверх фильтра. При добавлении среды очень важно избегать образования пузырьков воздуха, так как пузырьки будут препятствовать достаточному питанию клеток. Когда среда будет добавлена во все вкладыши, накройте планшет и перенесите вкладыши в инкубатор с пятипроцентным содержанием CO2 при температуре 37 градусов Цельсия.

Теперь промойте колбу с ячейками HIBCPP десятью миллилитрами ПВС, два раза с закручиванием. После второй промывки добавьте в ячейки три миллилитра 0,25-процентного трипсина ЭДТА и взболтайте колбу. Затем инкубируйте клетки в течение примерно двадцати минут.

В конце инкубации убедитесь, что ячейки оторвались от дна колбы и имеют круглую форму. Ячейки не отделяются полностью друг от друга и часто встречаются в агломератах. Повторно суспендируйте культуру 17 миллилитров среды, чтобы остановить реакцию, и переложите суспензию в 50-миллилитровую пробирку.

Затем раскрутите ячейки вниз и снова суспендируйте гранулу в соответствующем объеме среды для подсчета. Затем разбавьте ячейки до концентрации от одного до десяти-шестого клеток на миллилитр и переверните трубку, чтобы равномерно распределить клетки. Затем добавьте 80 микролитров ячеек в верхнюю часть каждой фильтрующей вставки.

Когда все вкладыши будут засеяны, накройте тарелку и верните ее в инкубатор для выращивания на ночь. На следующий день добавьте по одному миллилитру среды в каждую лунку 24-луночной пластины. Затем с помощью щипцов поднимите каждую вставку, выбросьте внутрь среду, поместив вставки лицевой стороной вверх в отдельные лунки 24-луночной пластины.

Когда фильтрующие вставки перевернуты с 12-луночной пластины на 24-луночную пластину, будьте осторожны, чтобы не касаться фильтрующей мембраны с растущими сверху клетками. Наполните вкладыши 0,5 миллилитрами свежей среды, и верните тарелку в инкубатор. Перекладывайте вкладыши в новую 24-луночную пластину со свежей средой каждые два дня, тем самым заменяя среду в верхнем отсеке.

Чтобы измерить трансэпителиальное электрическое сопротивление, или TEER клеток, сначала погрузите кончики электродов вольт-омметра эпителиальной ткани в 80 процентов этанола. Через 15 минут снимите электрод с этанола, чтобы дать электроду высохнуть. Затем поместите кончики в соответствующую субкультурную среду еще на 15 минут.

Когда электрод уравновешивается, расположите более длинный рычаг так, чтобы он касался дна нижнего отсека одной лунки планшета для клеточной культуры, а более короткий рычаг так, чтобы он дотягивался до отсека фильтрующей вставки. Измерьте значения сопротивления фильтрующих вставок клеточных культур в среде без ячеек, чтобы получить пустые значения. Затем измерьте TEER каждой из засеянных вставок.

После измерения поместите электрод обратно в 80-процентный этанол на 15 минут, после чего храните в сухой пробирке. Когда значения TEER засеянных вставок HIBCPP превышают 70 Ом на квадратный сантиметр, обновите среду с помощью свежей питательной среды с добавлением пяти микрограммов инсулина на миллилитр и одного процента FCS, и верните планшет в инкубатор для культивирования клеток на ночь. Для определения парацеллюлярной проницаемости культур вкладышей добавьте 50 микрограмм на миллилитр свежеприготовленного FITC-инулина в свежей сыворотке низкокультуральной среды в верхний фильтрующий отсек каждого вкладыша и верните клетки в инкубатор.

Когда культуры достигнут TEER около 500 Ом на квадратный сантиметр, заражают клетки бактериальной суспензией, представляющей интерес, при кратности инфекции 10 и возвращают клетки в инкубатор на соответствующий период культивирования. Затем трижды промойте ячейки, перенеся фильтр в новую лунку с одним миллилитром среды, не содержащей сыворотки. Каждый раз помещайте среду в фильтрующее отделение с 500 микролитрами той же среды, наконец, определяйте концентрацию инулина, прошедшего из фильтрующего отсека через клеточный слой после бактериальной инфекции, собирая образцы среды из нижнего отверстия каждой фильтрующей вставки для клеточных культур, и измеряя все образцы в микропланшетном ридере по сравнению с десятью стандартными разведениями FITC-инулина.

Клетки HIBCCP демонстрируют специфические барьерные функции, которые позволяют им ограничивать свои молекулярные обмены в умеренной степени. Например, иммунофлуоресцентный анализ типового соединения, связанного с белком ZO-1, окклюдином и клаудином-1, выявляет непрерывный сигнал в местах межклеточного контакта. Иллюстрируя взаимосвязанность клеток непрерывными нитями плотных соединений.

При культивировании в соответствующих условиях клетки HIBCPP демонстрируют высокий мембранный потенциал, который достигает примерно 500 Ом на квадратный сантиметр без обработки, сохраняя типичные барьерные функции гемато-спинномозгового жидкостного барьера, такие как формирование мембранного потенциала, а также низкую проницаемость для макромолекул. Однако по мере применения возрастающих концентраций ДМСО значения TEER снижаются дозозависимым образом, при этом аналогичное значительное снижение значения TEER наблюдается после лечения цитохалазином D. Более того, добавление двух объемных процентов ДМСО, или цитохалазина D, приводит к соответствующему значительному увеличению проницаемости для потока FITC-инулина.

Кроме того, бактериальная инфекция клеток HIBCCP приводит к значительному вторжению в клеточный слой двух патогенных штаммов бактерий. MC58 и его мутант с дефицитом капсулы. В то время как для апатогенного штамма альфа 14 наблюдается лишь незначительная инвазия.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что нельзя прикасаться к фильтрующей мембране после засеивания клеток, так как неповрежденный слой HIBCCP будет нарушен при контакте. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализы трансмиграции из пробирки, чтобы ответить на дополнительные вопросы о механизмах миграции иммунных и опухолевых клеток через эпителиальные клетки сосудистого сплетения. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области фармакологии к изучению переноса субстратов через эпителий сосудистого сплетения in vitro.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить HIBCCP клеточную модель гемато-спинномозгового жидкостного барьера для базального латерального инфицирования патогенами. Не забывайте, что работа с человеческими патогенами может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа под соответствующим защитным капюшоном.