Визуализации Центросомы в Fly семенников

Общая цель этой процедуры заключается в использовании генетически помеченных маркеров Centro Somal для скрининга новых генетических мутаций и раскрытия функции недавно идентифицированных генов Centro Somal. Это может быть достигнуто с помощью трех различных стратегий визуализации. Отслеживайте визуализацию живых яичек, трек В, химическую фиксацию яичек или трек С иммуноокрашивания.

Первым шагом процедуры является выделение яичек мух, экспрессирующих генетически помеченные сомальные белки centris, за чем может последовать немедленная визуализация. Вторым шагом является химическая фиксация яичек, за которой также может последовать визуализация. В-третьих, яички могут быть иммуноокрашены, а затем визуализированы.

В конечном счете, местоположение белков centri идентифицируется с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области центральной зоны, такие как молекулярная основа формирования центра, центральное удлинение и центральное разделение. Начните с выделения яичек дрозофилы, как подробно описано в публикации JoVE 2 6 4 1.

После выделения яичек погрузите образец в шесть микролитров свежеприготовленного буфера для окрашивания при комнатной температуре на положительно заряженном стеклянном предметном стекле микроскопа. Подождите 10 минут, затем аккуратно смойте излишки DPI, дважды заменив буфер для окрашивания. С шестью микролитрами PBS.

Будьте осторожны, чтобы не смыть семенники. Удалите растворы со предметного стекла, используя лист фильтровальной бумаги, чтобы отвести его. Шесть микролитровых объемов хорошо подходят для крышек площадью 18 квадратных миллиметров.

Теперь с помощью острого скальпеля можно проткнуть яички рядом с интересующим типом клеток, и это сводит к минимуму давление на эти клетки во время этапа сжатия. Затем аккуратно надеваем сверху на экземпляр покровный лист и заклеиваем его лаком для ногтей. Затем отметьте ручкой положение семенников на предметном стекле и приступайте к визуализации.

После выделения яичек погрузите их в каплю PBS объемом шесть микролитров на положительно заряженное стеклянное предметное стекло микроскопа. Вручную ориентируйте яички линейным образом или по другому усмотрению. Затем используйте лист фильтровальной бумаги, чтобы удалить PBS, и замените его шестью микролитрами свежеприготовленного фиксированного буфера.

После пяти минут в неподвижном буфере смойте его листом фильтровальной бумаги. Теперь погрузите образец в шесть микролитров свежеприготовленного буфера для окрашивания DPI на 10 минут. Смойте DPI, заменив его двумя шестилитровыми объемами PBS.

Затем аккуратно положите сверху на образец покровную крышку размером 18 квадратных миллиметров и заклейте ее лаком для ногтей. Затем отметьте расположение яичек на предметном стекле и приступайте к визуализации. Для этой процедуры сначала подготовьте силиконизированные покровные листы.

Сначала погрузите покровные стекла в небольшой лоток с силиконизированным раствором на минуту при комнатной температуре под вытяжной шкаф, убедитесь, что покровные стекла полностью оголены и не уложены друг на друга. Далее промойте чехлы три раза в воде по одной минуте за одну стирку. После этого следует три одноминутные промывки в 70% этаноле и последняя одноминутная промывка в воде.

Затем дайте силиконизированным защитным стеклам высохнуть на воздухе под вытяжным шкафом. После вскрытия нескольких семенников и гравировки предметного стекла с типом образца, затем добавьте пять микролитров PBS в силиконизированный покровный лист и перенесите семенники в каплю PBS. Для обеспечения успеха необходимо несколько защитных накладок, каждый с одним семенником.

Далее под микроскопом вскрытия осторожно прокалывают каждое из яичек, как показано ранее. Теперь аккуратно поместите положительно заряженный стеклянный микроскоп. Скользите по защитному закладу, позволяя PBS равномерно распределиться между защитным закладным и затвором.

Затем отведите лишний буфер между крышкой и слайдом, что увеличит давление на яички и раздавит их. Теперь опустите подготовленную горку в жидкий азот. Теперь можно подготовить и добавить в аквариум больше горок.

Прежде чем приступить к использованию больших щипцов, извлеките один из предметных стеблей из жидкого азота и быстро с помощью скальпеля удалите покровный лист. Образец должен оставаться на предметном стекле во время снятия защитного стекла с образца. Будьте осторожны, чтобы не размазать его по поверхности предметного стекла.

Этого можно достичь, используя скальпель, чтобы одним быстрым движением снять защитное стекло. Теперь инкубируйте предметные стекла в стеклянной банке для окрашивания коплана, наполненной метанолом. Охлаждается до минус 20 градусов по Цельсию в течение 15 минут.

После инкубации переложите предметные стекла в банку с содержанием ацетона. Охлаждается до минус 20 градусов по Цельсию после 30 секунд в ацетоне. Вымойте горки в течение минуты в PBS при комнатной температуре.

Далее инкубируйте предметные стекла в течение 10 минут в свежеприготовленном ПБСТ для блокировки неспецифических участков Во время инкубации ТБ ПБС заполните лунки влажной камеры водой. Через 10 минут снимите предметные стекла с ПБСТ и высушите каждое предметное стекло вокруг образца. Будьте осторожны, чтобы не высушить сам экземпляр. По мере высыхания каждой горки.

Поместите его во влагокамеру. Перед добавлением раствора антитела важно высушить область предметного стекла, окружающую образец. Это гарантирует, что антитело остается локализованным на образце, тем самым предотвращая высыхание на этапе инкубации.

Затем аккуратно капните на образцы 100 микролитров первичного антитела, разведенного в свежеприготовленном P-B-S-T-B-R. Используйте разведение от одного до 200 для нехарактерных антител. Затем поместите квадратный кусок параформы в один сантиметр поверх образца, чтобы распределить раствор антитела и защитить раствор антитела от испарения.

Дайте экземплярам поинкубироваться в течение часа при комнатной температуре. Через час с помощью щипцов аккуратно извлеките параформу из предметных стекол. Затем трижды промыть предметные стекла в ПБСТ при комнатной температуре в течение пяти минут за одну стирку.

После этого перенесите предметные стекла во влагокамеру образцом вверх, аккуратно добавьте на образцы 100 микролитров вторичного антитела, разведенного в PBST, BR. Как и раньше, нанесите параформ и подождите час, смойте вторичное тремя пятиминутными смываниями в PBST, а затем тремя пятиминутными смываниями в PBS. Затем тщательно промокните предметные стекла насухо, не касаясь экземпляров.

Добавьте шесть микролитров крепежного носителя и наклейте стандартный покровный лист. Запечатав покровное стекло лаком для ногтей и отметив положение семенников, приступайте к визуализации. Центросомы претерпевают множественные морфологические и функциональные трансформации в ходе сперматогенеза.

Одним из легко наблюдаемых процессов является удлинение центросом в сперматогонии, маркер LAR ANA one GFP отмечает 0,6 микрона длины, который удлиняется во время сперматогенеза и достигает длины 2,5 микрон у почти зрелых сперматид. Поскольку центрические масла сперматозоидов дрозофилы имеют уникальную длинную длину, визуализация может быть использована для получения количественных оценок относительно удлинения центросом. По сравнению с морфологией дикого типа, были выявлены различные мутации, которые изменяют центральный рост.

Два примера всегда являются ранними мутациями и мутациями пушечными ядрами, которые останавливают сперматогенез до начала мейоза, но не блокируют центовое удлинение у этих мутантов: центовые масла зрелых сперматоцитов вырастают примерно до 2,4 микрон по сравнению с центовыми маслами контрольных клеток, которые достигают максимальной длины 1,8 микрона. После освоения трек A может быть сделан за 20 минут, трек B — за 30 минут, а трек C — за три-пять часов, в зависимости от размера выборки. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как визуализировать центросому в полете.