Иммунофлуоресценции Анализ эндогенные и экзогенные Центромера-кинетохор Белки
3 марта 2016 г.
Здесь мы сообщаем о протоколах обнаружения эндогенных и экзогенных центромер-кинетохорных белков в клетках человека и количественно оцениваем эти уровни белков в центромер-кинетохорах путем непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием фиксации (фиксация параформальдегида, ацетона или метанола).
Общей целью данного непрямого иммунофлуоресцентного анализа является оптимизация локализации и количественного определения эндогенных и экзогенных центромер-кинетохорных белков, включая центромерный белок А и помеченные флагом экзогенные белки CENP-A в клетках человека. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как идентифицировать и количественно определить центромер-кинетохорные белки. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может быть использована для квалификации различных уровней центромерно-кинетохорной экспрессии в зависимости от выбранной анафазы, представляющей интерес.
Через 18 часов после посева культивируемые клетки однократно промыть PBS и добавить по 500 мкл восстановленной сывороточной среды в каждую лунку шестилуночного полистирольного планшета для культивирования. Затем трансфицируйте клетки в каждой лунке свежеприготовленным раствором смеси А и В и инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Через четыре с половиной часа замените DMEM со средним и высоким содержанием глюкозы с добавлением FBS и антибиотиками и верните планшет в инкубатор для клеточных культур.
Через 48–72 часа отсадите питательную среду для клеточных культур и промойте клетки один раз PBS, добавляя физиологический раствор по стенкам культуральных лунок, чтобы не нарушать клетки. Затем зафиксируйте клетки 4%-ным параформальдегидом на 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия. По окончании периода фиксации клетки дважды промыть буфером Kb2 и пермеабилизировать образцы в буфере Kb1 в течение 30 минут при комнатной температуре.
Затем промойте клетки один раз буфером Kb2 и блокируйте любое неспецифическое связывание добавлением свежего буфера Kb2. Через пять минут при комнатной температуре с помощью щипцов удалите засеянные покровные стекла из каждой лунки, а с помощью гидрофобной барьерной ручки нарисуйте гидрофобные барьеры вокруг каждого образца покровного стекла. Перенесите защитные стекла в новую шестилуночную полистирольную пластину и погрузите образцы в соответствующее первичное антитело на один час при температуре 37 градусов Цельсия.
Затем трижды промойте клетки буфером Kb2 и пометьте их соответствующим вторичным антителом еще на час при температуре 37 градусов Цельсия. В конце инкубации промойте образцы пятью 6-минутными промывками в буфере Kb2. Затем пометьте ядра клеток буфером Kb3, содержащим DapE, в течение пяти минут при комнатной температуре, после чего следует одна-две промывки в буфере Kb2 и повторное заполнение лунок буфером Kb2.
Теперь поместите каплю монтажного материала в центр одного предметного стекла микроскопа для каждого покровного стекла клеток и удалите всю жидкость из образцов клеток. Наконец, осторожно поместите каждый образец в центр одного из подготовленных предметных стекол микроскопа и удалите излишки монтажной среды бумажным полотенцем. Как было отмечено в этом репрезентативном эксперименте, уровни экспрессии эндогенного белка CENP-A в общих лизатах клеток, трансфицированных миРНК CUL4A, были аналогичны уровням экспрессии CENP-A в клетках, трансфицированных миРНК люциферазы.
Кроме того, уровни белка эндогенного CENP-A в общих лизатах клеток, трансфицированных миРНК RBX1, были аналогичны уровням эндогенного CENP-A в клетках, трансфицированных миРНК люциферазы, что позволяет предположить, что лигаза CUL4A RBX1 E3 необходима для локализации CENP-A в центромерах. Мутанты лизина CENP-A теряют способность локализоваться в центромерах, что позволяет предположить, что убиквитилирование CENP-A K124 имеет важное значение для локализации CENP-A в центромерах. Важно отметить, что экзогенное слияние моноубиквитина белка CENP-A спасло делокализацию мутанта CENP-A K124R, вернув белок в его центромерное положение.
После освоения процедуры фиксации клеток и иммунофлуоресцентного окрашивания могут быть завершены за пять-шесть часов, если они выполнены правильно. Не забывайте аккуратно наносить все растворы на боковые стороны лунок, чтобы клетки не выбились из покровных стекол при ополаскивании или погружении образцов. Не забывайте, что работа с нагретым параформальдегидом вне проветриваемого помещения или что легковоспламеняющиеся материалы вблизи огня могут быть чрезвычайно опасными, и что при выполнении этой процедуры всегда следует принимать соответствующие меры предосторожности.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлены протоколы обнаружения и количественного определения белков центромеры-кинетохора в клетках человека с помощью метода непрямой иммунофлуоресцентной окраски. Методы включают различные способы фиксации для оптимизации локализации этих белков.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Нейробиология
- Анализ белков
Теоретическая часть
- Белки центромера-кинетохора играют ключевую роль в делении клеток.
- Понимание их локализации и уровней экспрессии жизненно важно для исследований в области клеточной биологии.
- Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание является распространенным методом изучения этих белков.
- Различные методы фиксации могут влиять на детектирование этих белков.
Цель исследования
- Оптимизация локализации эндогенных и экзогенных белков центромеры-кинетохора.
- Количественное определение уровней белков в центромерах-кинетохорах клеток человека.
- Предоставление надежного протокола для исследователей в данной области.
Используемые методы
- Методы непрямой иммунофлуоресцентного окрашивания.
- Использование методов фиксации параформальдегидом, ацетоном или метанолом.
- Трансфекция культурных клеток специфическими белковыми конструкциями.
- Инкубация и смена среды для оптимизации экспрессии белка.
Основные результаты
- Успешная локализация центромерного белка А и белков CENP-A с FLAG-меткой.
- Количественное определение уровней белка на разных стадиях анафазы.
- Продемонстрирована эффективность различных методов фиксации.
- Представлен протокол, который может быть адаптирован для различных экспериментальных целей.
Выводы
- Данное исследование предлагает надежный метод изучения белков центромерно-кинетохорного комплекса.
- Полученные результаты позволяют углубить понимание динамики белков в процессе деления клеток.
- Представленные протоколы могут быть использованы в дальнейших исследованиях в области клеточной биологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественный иммунофлуоресцентный анализ белков центромерно-кинетохорного комплекса позволяет точно исследовать механизмы сегрегации хромосом, что является критически важным аспектом в изучении деления клеток. Данная возможность обеспечивает прогностическую уверенность при валидации мишеней и снижении механистических рисков в программах на стадии поиска, сосредоточенных на регуляции митоза. Надежные рабочие процессы локализации и количественного определения эндогенных и экзогенных белков способствуют принятию решений по формированию портфеля проектов в ранних исследованиях и трансляционной медицине.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет проводить прямую визуализацию и количественную оценку локализации белков центромеры и кинетохора в клетках человека.
- Способствует механистическому снижению рисков путем разграничения эффектов генетических или химических воздействий на адресную доставку белков.
- Облегчает функциональную валидацию потенциальных мишеней, участвующих в обеспечении точности сегрегации хромосом.
- Предоставляет количественные контрольные показатели для изучения сигнальных путей и проверки гипотез.
Скрининг и разработка методов анализа
- Представляет валидированные протоколы иммунофлуоресценции, адаптируемые для высокопроизводительного скрининга регуляторов митоза.
- Обеспечивает воспроизводимое обнаружение как эндогенных, так и экзогенных вариантов белков в различных экспериментальных условиях.
- Позволяет получать количественные результаты, подходящие для сравнительного анализа в рамках химического или генетического скрининга.
- Поддерживает стандартизацию анализа для исследований, проводимых в разных лабораториях и на разных платформах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям заболеваний за счет обеспечения возможности обнаружения неправильной локализации белков, связанной с хромосомной нестабильностью.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации, поддерживая количественное определение биомаркеров в инженерных клеточных системах.
- Способствует принятию обоснованных решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков на основе количественных данных о локализации белков.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный протокол иммунофлуоресценции интегрирован в непрерывный цикл от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая поддержку как ранних механистических исследований, так и последующей разработки анализов для идентификации ведущих соединений.
- Фундаментальная биология: позволяет проводить тестирование функций и локализации белков центромерно-кинетохорных комплексов на основе выдвинутых гипотез.
- Скрининг: обеспечивает количественную и воспроизводимую оценку иммунофлуоресценции для кампаний по скринингу митотических путей.
- Аналитика: поддерживает статистическое сравнение локализации и экспрессии белков в различных экспериментальных группах.
- Трансляционные исследования: связывают результаты фундаментальных открытий с доклиническими моделями путем количественного определения неправильной локализации белков, имеющей значение для синдромов хромосомной нестабильности.
- Корпоративное повторное использование: предлагает стандартизированный, адаптируемый рабочий процесс для различных белковых мишеней и клеточных систем.
Влияние на операционную и корпоративную деятельность
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность при валидации мишеней и снижает неопределенность механизмов в исследованиях путей митоза.
- Операционная ценность: Предоставляет стандартизированные, масштабируемые протоколы для воспроизводимого иммунофлуоресцентного анализа.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет предоставления надежных количественных данных.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию мишеней и программ с учетом рисков на основе данных о механизмах действия.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с иммунофлуоресцентной микроскопией и количественным анализом изображений.
- Необходим доступ к валидированным антителам и высококачественному оборудованию для визуализации.
- Для обеспечения воспроизводимости требуется межгрупповая стандартизация протоколов фиксации и окрашивания.
- Метод применим к различным клеточным моделям, однако может потребовать оптимизации для конкретных белковых меток или способов химической фиксации.
- Обязательно осторожное обращение с опасными реагентами и строгое соблюдение протоколов техники безопасности.
