Иммунофлуоресценции Анализ эндогенные и экзогенные Центромера-кинетохор Белки

Здесь мы сообщаем о протоколах обнаружения эндогенных и экзогенных центромер-кинетохорных белков в клетках человека и количественно оцениваем эти уровни белков в центромер-кинетохорах путем непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием фиксации (фиксация параформальдегида, ацетона или метанола).

Общей целью данного непрямого иммунофлуоресцентного анализа является оптимизация локализации и количественного определения эндогенных и экзогенных центромер-кинетохорных белков, включая центромерный белок А и помеченные флагом экзогенные белки CENP-A в клетках человека. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как идентифицировать и количественно определить центромер-кинетохорные белки. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может быть использована для квалификации различных уровней центромерно-кинетохорной экспрессии в зависимости от выбранной анафазы, представляющей интерес.

Через 18 часов после посева культивируемые клетки однократно промыть PBS и добавить по 500 мкл восстановленной сывороточной среды в каждую лунку шестилуночного полистирольного планшета для культивирования. Затем трансфицируйте клетки в каждой лунке свежеприготовленным раствором смеси А и В и инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Через четыре с половиной часа замените DMEM со средним и высоким содержанием глюкозы с добавлением FBS и антибиотиками и верните планшет в инкубатор для клеточных культур.

Через 48–72 часа отсадите питательную среду для клеточных культур и промойте клетки один раз PBS, добавляя физиологический раствор по стенкам культуральных лунок, чтобы не нарушать клетки. Затем зафиксируйте клетки 4%-ным параформальдегидом на 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия. По окончании периода фиксации клетки дважды промыть буфером Kb2 и пермеабилизировать образцы в буфере Kb1 в течение 30 минут при комнатной температуре.

Затем промойте клетки один раз буфером Kb2 и блокируйте любое неспецифическое связывание добавлением свежего буфера Kb2. Через пять минут при комнатной температуре с помощью щипцов удалите засеянные покровные стекла из каждой лунки, а с помощью гидрофобной барьерной ручки нарисуйте гидрофобные барьеры вокруг каждого образца покровного стекла. Перенесите защитные стекла в новую шестилуночную полистирольную пластину и погрузите образцы в соответствующее первичное антитело на один час при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем трижды промойте клетки буфером Kb2 и пометьте их соответствующим вторичным антителом еще на час при температуре 37 градусов Цельсия. В конце инкубации промойте образцы пятью 6-минутными промывками в буфере Kb2. Затем пометьте ядра клеток буфером Kb3, содержащим DapE, в течение пяти минут при комнатной температуре, после чего следует одна-две промывки в буфере Kb2 и повторное заполнение лунок буфером Kb2.

Теперь поместите каплю монтажного материала в центр одного предметного стекла микроскопа для каждого покровного стекла клеток и удалите всю жидкость из образцов клеток. Наконец, осторожно поместите каждый образец в центр одного из подготовленных предметных стекол микроскопа и удалите излишки монтажной среды бумажным полотенцем. Как было отмечено в этом репрезентативном эксперименте, уровни экспрессии эндогенного белка CENP-A в общих лизатах клеток, трансфицированных миРНК CUL4A, были аналогичны уровням экспрессии CENP-A в клетках, трансфицированных миРНК люциферазы.

Кроме того, уровни белка эндогенного CENP-A в общих лизатах клеток, трансфицированных миРНК RBX1, были аналогичны уровням эндогенного CENP-A в клетках, трансфицированных миРНК люциферазы, что позволяет предположить, что лигаза CUL4A RBX1 E3 необходима для локализации CENP-A в центромерах. Мутанты лизина CENP-A теряют способность локализоваться в центромерах, что позволяет предположить, что убиквитилирование CENP-A K124 имеет важное значение для локализации CENP-A в центромерах. Важно отметить, что экзогенное слияние моноубиквитина белка CENP-A спасло делокализацию мутанта CENP-A K124R, вернув белок в его центромерное положение.

После освоения процедуры фиксации клеток и иммунофлуоресцентного окрашивания могут быть завершены за пять-шесть часов, если они выполнены правильно. Не забывайте аккуратно наносить все растворы на боковые стороны лунок, чтобы клетки не выбились из покровных стекол при ополаскивании или погружении образцов. Не забывайте, что работа с нагретым параформальдегидом вне проветриваемого помещения или что легковоспламеняющиеся материалы вблизи огня могут быть чрезвычайно опасными, и что при выполнении этой процедуры всегда следует принимать соответствующие меры предосторожности.