Кучность биоактивные белки или пептидов на гидрогеля с помощью фотохимии биологических приложений

Общая цель данной методики заключается в создании иммобилизованных биоактивных пространственных белковых паттернов, которые могут быть использованы для изучения клеточных ответов. Данный метод позволяет воспроизводить сигналы in-vivo с помощью стратегий использования биоматериалов. Эта техника обеспечивает точную имитацию определенных сигнальных мотивов, которые невозможно реализовать с помощью стандартных методов культивирования, таких как последовательное воздействие факторов роста, межклеточная сигнализация и пространственно-специфические биохимические стимулы.

Данный протокол имеет важное значение для существующих методов, так как он предлагает простой способ регулирования жесткости субстрата и паттернирования белков. Этот метод может способствовать развитию технологий тканевой инженерии и регенеративной медицины, а также может быть применен для изучения других систем, таких как развитие тканей и судьба стволовых клеток. Для начала в стерильных условиях подготовьте основные растворы для главного компонента гидрогеля — полиэтиленгликольдиакрилата, фотоинициатора — лития фенил-2, 4, 6-триметилбензоилфосфината и белка ВКМ — фибронектина, согласно описанию в прилагаемом текстовом протоколе.

Перед использованием или хранением отдельных аликвот стерилизуйте каждый раствор путем фильтрации через шприцевой фильтр с размером пор 0.22 micron. Затем оберните раствор PEG-DA фольгой для защиты от света. Оберните исходный раствор фотоинициатора фольгой для защиты от света и храните приготовленный раствор при температуре four degree celsius в течение нескольких месяцев.

Если стоковый раствор фибронектина заморожен, дайте стерильной аликвоте оттаять на льду в течение нескольких часов или при температуре four degree celsius в течение ночи. Начните с автоклавирования одного полиэстерового листа для каждой формы для геля. Затем вымочите два предметных стекла в трех пластиковых прокладках для каждой формы для геля в 70% ethanol не менее двух часов.

Кроме того, замочите по пять зажимов для каждой формы для геля в 70% ethanol в течение 10 минут. Поместите предметные стекла, прокладки и зажимы на небольшой автоклавируемый лист в ламинарном шкафу для культивирования клеток, чтобы они высохли на воздухе в течение нескольких часов. Затем подготовьте формы для гидрогеля, разместив пластиковые прокладки толщиной 0.5 millimeter по краю предметного стекла.

Поместите сверху второе предметное стекло, затем плотно закрепите распорки друг к другу с помощью зажимов для бумаг. В завершение проведите поверхностную стерилизацию формы, поместив ее в ламинарный шкаф и включив УФ-лампу на 30 минут перед использованием. В середине процесса стерилизации переверните форму, чтобы обеспечить облучение обеих поверхностей.

Приготовьте растворы предшественников геля, как описано в таблице 1 прилагаемого текстового протокола. Затем смешайте объемы PEG-DA, фибронектина и фотоинициатора для создания гидрогеля. Интенсивно перемешайте раствор с помощью пипетки для обеспечения гомогенности, избегая образования пузырьков.

Осторожно внесите раствор-предшественник геля пипеткой между двумя стеклянными предметными стеклами формы для геля. Затем поместите форму под УФ-лампу и подвергните воздействию света в течение одной-двух минут для формирования гидрогеля. После полимеризации снимите зажимы и осторожно удалите верхнее предметное стекло, приложив давление в противоположных направлениях к двум боковым проставкам.

Затем с помощью биопсийного панча подходящего размера вырежьте образцы гидрогеля. Вырежьте несколько образцов из прямоугольника геля, чтобы использовать их в качестве повторностей и контрольных образцов. Стерилизуйте фотошаблон, выдержав его в 70% ethanol в течение 10 минут.

Затем дайте фотошаблону высохнуть на воздухе в ламинарном шкафу для культур клеток. После этого нанесите пипеткой от 1 до 2 µL на см² раствора тиолированного белка на поверхность каждого вырезанного гидрогеля для создания поверхностного паттерна. Важно равномерно распределить раствор белка по поверхности гидрогеля, чтобы обеспечить однородную иммобилизацию белка.

Осторожно поместите фотомаску на поверхность гидрогеля. Слегка нажмите на маску, чтобы удалить пузырьки воздуха, образовавшиеся между маской и поверхностью гидрогеля. Затем поместите гидрогель под УФ-излучатель и подвергните его повторному УФ-облучению в течение 30–60 секунд.

Промойте гидрогели раствором PBS для удаления всех непрореагировавших компонентов и поместите каждый гидрогель в лунку планшета так, чтобы поверхность с рисунком была обращена вверх. Затем промойте гели в PBS в течение ночи при температуре 4 °C. Удалите PBS из лунок, затем добавьте по 250 µL базальной среды EGM2 в каждую лунку и инкубируйте гели от 5 до 10 минут при температуре 37 °C.

Во время инкубации обработайте трипсином чашку с почти сливными HUVEC до получения суспензии из отдельных клеток, используя стандартные методы. Затем центрифугируйте клеточную суспензию и осторожно удалите супернатант. Ресуспендируйте клеточный осадок в базовой среде EGM2 без добавления факторов роста и нанесите часть клеточной суспензии в гемоцитометр.

Подсчитайте количество клеток для определения концентрации. Затем центрифугируйте планшет с гидрогелями при 300 x G в течение трех минут, чтобы убедиться, что гидрогели находятся на дне лунки и не плавают. Крайне важно, чтобы гидрогели не плавали в лунках.

Плавающие гидрогели ограничат эффективность посева клеток и создадут проблемы при визуализации гидрогеля. Медленно внесите пипеткой 75 000 клеток на сантиметр квадратный в центр поверхности каждого гидрогеля, чтобы не сместить гели. Затем поместите планшет в инкубатор для культур клеток при 37 °C.

В течение нескольких дней периодически извлекайте чашку, чтобы наблюдать за миграцией клеток в ответ на белковый паттерн. Каждые два-три дня заменяйте 50% среды. При формировании гидрогелей можно использовать различные концентрации предшественника ПЭГ-диакрилата для получения требуемой жесткости субстрата.

Как показано здесь, 20% раствор PEG-DA соответствует жесткости свыше 100 килопаскалей. Также важно учитывать как концентрацию фотоинициатора, так и время УФ-облучения, так как увеличение любого из этих параметров снизит биоактивность прикрепленных молекул, что в данном случае представлено биоактивностью лизосомы. Минимизация УФ-облучения во время формирования гидрогеля имеет решающее значение для сохранения свободных акрилатных функциональных групп для последующих реакций иммобилизации белков.

Гидрогели, подвергавшиеся воздействию УФ-излучения более двух минут, не позволяют создавать иммобилизованные белковые паттерны, показанные красным цветом. Кроме того, при увеличении времени УФ-облучения белкового паттерна с поверхностью реагирует большее количество белков. При правильном приготовлении на такие структурированные гидрогелевые подложки можно культивировать клетки для манипулирования их поведением.

В данной работе эндотелиальные клетки были равномерно распределены по поверхности ПЭГ-гидрогелей с паттерном VEGF. Через два дня после посева наблюдалась миграция эндотелиальных клеток в те области гидрогеля, где был иммобилизован VEGF. После освоения данного протокола исследователи могут использовать его для иммобилизации любого белка или пептида с целью изучения новых биоактивных платформ для клеточных систем in vitro.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости минимизировать концентрацию фотоинициатора и время воздействия УФ-излучения для сохранения биоактивности иммобилизованных молекул. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать паттерны из биоактивных белков и пептидов на ПЭГ-гидрогелях, равномерно высевать клетки на гидрогели и наблюдать за последующим клеточным ответом.