Кучность биоактивные белки или пептидов на гидрогеля с помощью фотохимии биологических приложений

Общей целью данной методологии является создание иммобилизованных биоактивных пространственных белковых паттернов, которые будут использоваться для изучения клеточных реакций. Этот метод позволяет рекапитуировать сигналы in vivo с использованием стратегий биоматериала. Этот метод позволяет точно имитировать определенные сигнальные мотивы, которые не могут быть достигнуты с помощью стандартных методов культивирования, таких как последовательные факторы роста, сигнализация клеток клеток и пространственные специфические биохимические сигналы.

Этот протокол имеет важное значение для существующих методов, поскольку он обеспечивает упрощенный метод регулировки жесткости субстрата и структуры белка. В то время как этот метод может способствовать развитию технологий тканевой инженерии и регенеративной медицины, он также может быть применен для изучения других систем, таких как развитие тканей и судьба стволовых клеток. Для начала приготовьте исходные растворы для основного гидрогелевого компонента, диакрилата полиэтиленгликоля, фотоинициатора, фенил-2, 4, 6-триметилбензоилфосфината лития и белка ECM, фибронектина, в стерильных условиях, как описано в сопроводительном текстовом протоколе.

Фильтр стерилизует каждый раствор с помощью шприцевого фильтра 0,22 микрона перед использованием или хранением отдельных аликвот. Затем оберните раствор PEG-DA пленкой, чтобы защитить его от света. Заверните стоковый раствор фотоинициатора в фольгу, чтобы защитить его от света, и храните приготовленный раствор при температуре четыре градуса Цельсия до нескольких месяцев.

Если стоковый раствор фибронектина заморожен, дайте стерильной аликвоте оттаять на льду в течение нескольких часов или при четырех градусах Цельсия за ночь. Начните с автоклавирования одного листа полиэстера для каждой гелевой формы. Затем замочите два предметных стекла в трех пластиковых прокладках для каждой гелевой формы в 70% этаноле не менее чем на два часа.

Кроме того, замочите пять связующих зажимов для каждой гелевой формы в 70% этаноле на 10 минут. Поместите стеклянные предметные стекла, дистанционные рамки и связующие зажимы на небольшой лист автоклава в колпаке для клеточных культур, чтобы дать им высохнуть на воздухе в течение нескольких часов. Затем подготовьте гидрогелевые формы, поместив пластиковые распорки толщиной 0,5 миллиметра по краю предметного стекла.

Поместите сверху второе предметное стекло, а затем плотно закрепите распорки рядом друг с другом связующими зажимами. Наконец, простерилизуйте поверхность формы, поместив ее в колпак и включив ультрафиолетовый свет на 30 минут перед использованием. В середине процесса стерилизации переверните форму, чтобы обнажить обе поверхности.

Создание растворов прекурсора геля в соответствии с приведенной в таблице 1 прилагаемого текстового протокола. Затем смешайте объемы PEG-DA, фибронектина и фотоинициатора, чтобы получить гидрогель. Энергично пипетируйте раствор, чтобы получить однородный раствор, но избегайте образования пузырьков.

Осторожно нанесите пипеткой раствор прекурсора геля между двумя стеклянными предметными стеклами гелевой формы. Затем поместите форму под ультрафиолетовый свет и выдержите ее на одну-две минуты, чтобы образовался гидрогель. После гелеобразования снимите связующие зажимы и аккуратно снимите верхнюю стеклянную застежку, оказав противоположное давление на две боковые распорки.

Затем с помощью биопсийного перфоратора соответствующего размера вырезайте образцы гидрогеля. Выбейте несколько гидрогелей из прямоугольника геля, чтобы они служили репликами и контрольными образцами. Простерилизуйте фотомаску, замочив ее в 70% этаноле на 10 минут.

Затем дайте фотомаске высохнуть на воздухе в капюшоне для клеточных культур. Затем пипеткой нанесите один-два микролитра на квадратный сантиметр раствора тиолированного белка на поверхность каждого вырезанного гидрогеля для нанесения рисунка на поверхность. Важно равномерно распределить белковый раствор по поверхности гидрогеля, чтобы обеспечить равномерную иммобилизацию белка.

Аккуратно поместите фотомаску на поверхность гидрогеля. Аккуратно надавите на маску, чтобы удалить пузырьки, образующиеся между маской и гидрогелевой поверхностью. Затем поместите гидрогель под ультрафиолетовый свет и подвергните его воздействию второго раунда ультрафиолетового света в течение 30-60 секунд.

Промойте гидрогели PBS, чтобы удалить все непрореагировавшие частицы, и поместите каждый гидрогель в луночную пластину так, чтобы поверхность рисунка была обращена вверх. Затем промойте гели на ночь в PBS при температуре четыре градуса Цельсия. Удалите PBS из лунок, затем добавьте 250 микролитров базального EGM2 в каждую лунку и инкубируйте гели в течение пяти-10 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Во время инкубации трипсин переваривает пластину почти сливающихся HUVEC в одноклеточную суспензию с использованием стандартных методов. Затем раскрутите клеточную суспензию вниз и осторожно удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клеточную гранулу и базальный EGM2 без добавления факторов роста и добавьте некоторое количество клеточной суспензии в гемоцитометр.

Посчитайте ячейки, чтобы определить концентрацию. Затем опустите пластину, содержащую гидрогели, при давлении 300 x G в течение трех минут, чтобы убедиться, что гидрогели расположены на дне лунки и не плавают. Крайне важно, чтобы гидрогели не плавали в скважинах.

Плавающие гидрогели ограничивают успех посева клеток и вызывают проблемы с визуализацией гидрогеля. Медленно пипетируйте 75 000 клеток на сантиметр в квадрате к центру поверхности каждого гидрогеля, чтобы не повредить гели. Затем поместите планшет в инкубатор для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия.

В течение нескольких дней периодически снимайте чашку, чтобы наблюдать за миграцией клеток в ответ на рисунок белка. Обменивайтесь 50% носителей каждые два-три дня. При формировании гидрогелей можно использовать различные концентрации предшественников ПЭГ-диакрилатов для получения желаемой жесткости субстрата.

Показанный здесь раствор 20% PEG-DA коррелирует с жесткостью более 100 килопаскалей. Также важно учитывать как концентрацию фотоинициатора, так и время воздействия ультрафиолета, поскольку увеличение любой из переменных приведет к снижению биологической активности прикрепленных молекул, представленной в данном случае биологической активностью лизосомы. Сведение к минимуму воздействия ультрафиолета во время формирования гидрогеля имеет решающее значение для поддержания функциональных групп свободных акрилатов для последующих реакций иммобилизации белков.

Гидрогели, подвергшиеся воздействию ультрафиолетового света дольше двух минут, не способны создавать иммобилизованные белковые узоры, показанные красным цветом. Кроме того, по мере увеличения воздействия ультрафиолета на белковый рисунок, большее количество белков реагирует на поверхность. При правильном приготовлении клетки могут быть культивированы на этих узорчатых гидрогелевых субстратах, чтобы манипулировать их поведением.

Здесь эндотелиальные клетки равномерно засеивались на поверхность гидрогелей PEG по схеме VEGF. Через два дня после посева наблюдалось, что эндотелиальные клетки мигрируют в сторону пространственных областей гидрогеля, содержащего иммобилизованный VEGF. После разработки этого протокола исследователи могут использовать его для иммобилизации любого белка или пептида с целью изучения новых биоактивных платформ для клеточных систем in vitro.

При проведении этой процедуры важно помнить о минимизации концентрации фотоинициатора и времени воздействия ультрафиолета для поддержания биологической активности иммобилизованных молекул. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как формировать биологически активные белки и пептиды на гидрогелях ПЭГ, затравочные клетки равномерно на гидрогелях и наблюдать за последующей реакцией клеток.