Изучение воздействия Матрица жесткости на клеточную функцию использования на основе акриламида Гидрогели

Моделировать in vivo податливость тканей с помощью акриламидных гидрогелей. Это достигается путем создания сначала реактивных накладок нижней крышки и силиконизированных накладок верхней крышки. Вторым этапом процедуры является заливка и создание акриламидных гидрогелей.

Третьим этапом процедуры является перекрестное сшивание выбранного белка внеклеточного матрикса с гидрогелем. Завершающим этапом процедуры является инкубация и анализ клеток. В конечном счете, можно получить результаты, которые показывают, как изменение податливости внеклеточного матрикса in vitro регулирует поведение клеток с помощью анализа с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии, количественной ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинга.

Сегодня мы покажем вам процедуру получения и использования акриламидных гидрогелей. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения жесткости нашего внеклеточного матрикса, регулирующей морфологию клеток, клеточную сигнализацию и пролиферацию. Итак, приступим.

Начните эту процедуру с создания реактивных защитных слипов. Сначала положите слой параформы на нижнюю половину 150-миллиметровой чашки Петри. Затем переложите до девяти автоклавных 25-миллиметровых накладок на пара-пленку и накройте их одним миллилитром 0,1 молярного гидроксида натрия.

Инкубируйте покровные стекла в течение трех минут После инкубации отасканируйте гидроксид натрия с помощью вакуумной линии, работающей в химической колпаковой пипетке, 0,5 миллилитров трех аминопрофильных триметиловых или трех A-P-T-M-S на каждом покровном листе. Инкубируйте крышки в течение трех минут, а затем аспирируйте три A-P-T-M-S. Будьте осторожны, чтобы не инкубировать слишком долго, чтобы избежать образования пены на крышке.

Скольжение после лечения. Промойте крышку листка один раз 20 миллилитрами деионизированной воды в той же посуде. Снимите накладки крышки с чашки с помощью изогнутых щипцов и перенесите их обработанной стороной вверх на новую 150-миллиметровую посуду.

Затем снова промойте чехлы деионизированной водой и положите их на коромысло на 10 минут. После инкубации удалите воду и промойте еще два раза. Очень важно удалить все три A-P-T-M-S, чтобы они не вступили в реакцию с глутаральдегидом и не оставили мутный белый осадок за 10 минут до использования глутарового альдегида.

Используя изогнутые щипцы, перенесите покровные листы в чистую чашку, покрытую слоем парама, и отсасывайте оставшуюся жидкость Используя вакуумную линию, затем полностью накройте каждый покровный лист 0,5 миллилитрами 0,5% глутаральдегида в стерильной деионизированной воде, чтобы сшить три A-P-T-M-S и полиакриламидный гель. Выдержите покровные стекла в течение 30 минут в химической вытяжке. Затем аспирируйте глутаральдегид, промойте и снова промойте покровные стекла деионизированной водой.

Затем полностью высушите чехлы чехла. Добавьте новые защитные стекла в 50-миллилитровую трубку Falcon, содержащую 10% раствор поверхностного уплотнения в хлороформе, и проведите в горной породе не менее 10 минут. Сцедите раствор поверхностного уплотнения и высушите на воздухе.

Крышка надевается на салфетки Ким в шкафу биологической безопасности, где будут подготовлены гидрогели для начала подготовки гидрогеля. С помощью изогнутых щипцов перенесите реактивную сторону защитного стекла вверх на лист параформы, который был приклеен к поверхности шкафа биологической безопасности. Следите за тем, чтобы покровные накладки ровно прилегали к поверхности параформы.

Затем приготовьте насыщенный и гидроксираствор CIN или раствор NHS в толуоле, растворив небольшое количество NHS в достаточном количестве толуола. Для конкретных экспериментов добавляйте небольшое количество NHS до тех пор, пока NHS не перестанет растворяться. Насыщенный раствор обычно мутный и розового цвета.

Затем приготовьте акриламид BIS Акриламидная вода и PS для достижения желаемого процентного содержания акриламида. Добавьте реагенты в микропробирки, как указано в письменном протоколе. Затем по одной аликвоте за раз.

Добавьте NHS и TM me. Кратковременно и немедленно влейте от трех до пяти гелей, используя 140 микролитров на каждый защитный стакан в шкафах биологической безопасности. Быстро поместите СИЛИКОНИЗИРОВАННЫЙ 25-миллиметровый защитный лист поверх каждого геля, прежде чем он начнет полимеризуться.

Добавление верхнего покровного стекла позволит акриламиду полностью покрыть нижнее покровное покрытие. Инкубируйте этот бутерброд при комнатной температуре, пока акриламид не полимеризуется, чтобы определить, когда произошла полимеризация. Проверьте остаточный раствор акриламида в микроцентрифужной пробирке.

Полимеризация займет несколько минут для жестких гелей и немного больше для мягких гелей. После того, как полимеризация произошла, осторожно возьмите бутерброд в стерильных перчатках. Затем сдвиньте верхнюю крышку до тех пор, пока она не нависнет над полимеризованным гелем.

Затем подденьте крышку. Снимите гель, выбросьте верхнюю крышку. Поместите каждую нижнюю крышку геля, далее называемую гидрогелем, в шестилуночную пластину.

Затем добавьте два миллилитра фосфатного буферного раствора или PBS на лунку шестилуночной пластины. Затем промойте гидрогели PBS и выдержите на коромысле в течение пяти минут. Повторите эту стирку два раза.

Чтобы начать эксперимент, покройте каждый гидрогель двумя миллилитрами раствора фибронектина или другого белка внеклеточного матрикса. Инкубируйте белок на гидрогеле в течение ночи при четырех градусах Цельсия, чтобы он мог ковалентно связываться с гидрогелем, после ночной инкубации аспирируйте раствор ECM. Затем заблокируйте нереактивную NHS одним миллиграммом на миллилитр нагревательного активированного бычьего сывороточного альбумина без жирных кислот в среде без сыворотки и инкубируйте не менее 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

После инкубации промойте гидрогели один раз стерильным PBS. Далее поместите клетки в соответствующую культивируемую среду, содержащую эмбриональную бычью сыворотку. Перейдем к гидрогелю здесь.

Для создания мышиных эмбриональных фибробластов используются. Определите количество клеток, которые должны быть засеменены на гидрогеле, исходя из степени распространения клеток и слияния, необходимых для эксперимента. Примерно от 10 до пяти клеток необходимо для вестерн-блоттинга и количественного ПЦР-анализа.

Затем инкубируйте клетки в условиях, соответствующих конкретному типу клеток. После инкубационного периода. Извлеките клеточный белок или мРНК в соответствии с потребностями.

Пипеткой капли 100 микролитров лизисного буфера нанесите на лист параформы на лабораторном столе, оставляя примерно два-три сантиметра между каждой каплей. Далее аккуратно снимите каждый гидрогель, подняв нижнее крышечное стекло из лунки. С помощью изогнутых щипцов и помещаем его клеточной стороной вниз поверх капель.

Инкубируйте клетки с буфером для лизиса ровно в течение одной минуты. Наконец, снимите крышки и перенесите буфер для лизиса в микроцентрифужную пробирку. В качестве альтернативы, при экстракции РНК перенесите каждый гидрогель в новую шестилуночную пластину и добавьте один миллилитр триазола на лунку.

Инкубируйте гели в течение трех минут после инкубации. Извлеките раствор триазола для хранения в микроцентрифужной пробирке. Тщательная промывка покровных накладок после добавления A-P-T-M-S является важным этапом в производстве реактивных покровных накладок.

Правильно вымытые и высушенные чехлы не должны содержать остатков осадка. A-P-T-M-S вступает в реакцию с глутаровым альдегидом и образует белый мутный осадок. Если выпал осадок, всю процедуру необходимо повторить, так как покровное стекло больше не пригодно для использования.

После формирования гидрогеля и покрытия белками ECM происходит посев клеток в течение ночи. Существует явная разница между клетками, растекающимися на жестких и мягких гидрогелях, что видно по foid при окрашивании, и клеткам эмбриональных фибробластов мыши, которые распространяются в большей степени на жестких и мягких гидрогелях. Действительно, большинство клеток, прикрепляющихся к мягкому гидрогелю, остаются компактными и прикрепляются менее эффективно.

Репрезентативные количественные результаты ПЦР по циклированию уровней мРНК D one в эмбриональных фибробластах мышей показывают, что циклирование D one значительно повышено на жесткой матрице, но не на мягкой. Это говорит о том, что жесткость матрикса регулирует прогрессию клеточного цикла in vitro. Мы только что показали вам, как создать гидрогелевую режущую жесткость, моделирование in vivo физиологические условия При выполнении этой процедуры важно помнить о дополнительных реактивных соскальзываниях крышки, так как могут произойти несчастные случаи и ошибки.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.