Простой основе полиакриламида многолуночные Жесткость Анализ по изучению жесткости зависимых клеточных ответов

Общая цель данной процедуры заключается в обеспечении быстрого, эффективного и недорогого приготовления полиакриламидных гелей в формате многолуночного планшета. Это достигается путем создания «сэндвича» из раствора-предшественника геля между стеклянной пластиной с гидрофобным покрытием и гибкой пластиковой подложкой с акриламидным адгезивным слоем. На втором этапе гель, который после полимеризации ковалентно прикрепился к гибкой пластиковой подложке, отделяют от стеклянной пластины и подвергают сушке.

Затем сухой гель и подлежащая гибкая пластиковая поддержка вырезаются по нужной форме и приклеиваются пластиковой стороной вниз к дну лунок многолуночного планшета или любого другого сосуда для культивирования клеток. Заключительным этапом является нанесение на собранные в многолуночном планшете полиакриламидные гели адгезивного покрытия для клеток, например, монослоя коллагена I типа. В конечном итоге для наблюдения за влиянием подлежащего полиакриламидного субстрата используются микроскопия, а также другие методы характеристики клеток.

В частности, влияние жесткости на поведение клеток. Основным преимуществом данного метода перед существующими является возможность работы с любой жесткостью и толщиной полигелей, а также их размещения в формате многолуночного планшета, что является экономически выгодным и эффективным по времени способом, не доступным при использовании других методов. Демонстрация процедуры будет проведена студентом в моей лаборатории.

Сначала подготовьте раствор-предшественник полиакриламидного геля, смешав акриламид, сшивающий агент бисакриламид и деионизированную воду; растворите Sul OPA в диметилсульфоксиде в концентрации 50 mg/mL. Распределите по 20 µL стокового раствора в 10 микроцентрифужных пробирки. Затем подвергните растворы мгновенной заморозке в жидком азоте и храните при температуре -80 °C.

Затем растворите персульфат аммония в деионизированной воде до достижения конечной концентрации персульфата аммония 10% по весу в объеме. Раздайте по 25 µL раствора персульфата аммония в 10 микроцентрифужных пробирки и храните при температуре -20 °C. Приготовьте раствор коллагена с концентрацией 0,2 mg/mL, разбавив исходный раствор коллагена I типа в 1XPBS при pH 7.4.

Все растворы следует хранить на льду до использования. На этом этапе нанесите несколько капель гидрофобного раствора на стеклянную пластинку и с помощью бумажной салфетки распределите его по всей поверхности. После высыхания пластинки на воздухе снова протрите ее бумажной салфеткой, чтобы выровнять гидрофобное покрытие.

Отрежьте гибкую пластиковую подложку так, чтобы она соответствовала размеру стеклянной пластины с гидрофобным покрытием. Затем отметьте гидрофобную сторону гибкой пластиковой подложки, слегка поцарапав поверхность острым инструментом, например скальпелем. Для приготовления геля добавьте 4972.5 µL раствора-предшественника полиакриламида с желаемой конечной концентрацией в коническую пробирку объемом 50 mL.

Поместите пробирку в дегазационную камеру на 30 минут с открытой крышкой. После этого добавьте 25 µL предварительно приготовленного раствора персульфата аммония в раствор геля DGAs, чтобы конечная концентрация персульфата аммония составила 0.05%. Затем добавьте 2,5 µL TM me для достижения конечной концентрации TM ME 0,5%. Осторожно перемешайте раствор, прокачав его пипеткой вверх-вниз от трех до пяти раз. Затем установите силиконовые прокладки нужной толщины на гидрофильную сторону гибкой пластиковой подложки.

Затем дозированно нанесите раствор геля на гибкую пластиковую подложку между спейсерами и прижмите сверху стеклом, покрытым гидрофобным слоем. После полимеризации геля в течение 45 минут отделите гибкую пластиковую подложку с ковалентно прикрепленным полиакриламидным гелем сверху и поместите ее гелевой стороной вверх для высушивания на воздухе. После высыхания разрежьте полиакриламидный гель до нужной формы.

Приготовьте примерно 500 µL полиметилметакрилата на одну 96-луночную планшетку в соответствии с инструкциями производителя для приклеивания гелей к дну многолуночного планшета. С помощью пинцета нанесите маленькую каплю полиметилметакрилата в центр каждой лунки. Поместите по одному полиакриламидному гелю в каждую лунку гибкой пластиковой стороной supports вниз.

После отверждения полидиметилсилоксана с помощью переносной пипетки поместите небольшое количество предварительно приготовленного образца целлюлозы в каждую лунку и аккуратно перемешайте содержимое из стороны в сторону, чтобы равномерно покрыть поверхность геля. Поместите планшет с лунками под лампу с высокоинтенсивным УФ-излучением на пять минут. По завершении промойте гели раствором PBS, чтобы удалить излишки целлюлозы.

С помощью этой пипетки внесите примерно 50 µL предварительно приготовленного раствора коллагена 1 типа в каждую лунку. Оставьте планшет закрытым при комнатной температуре минимум на два часа, после чего промойте лунки PBS для удаления избытка раствора коллагена. Стерилизуйте гели под УФ-лампой в вытяжном шкафу для культивирования тканей в течение двух часов.

Наконец, замочите гели в полной среде на ночь для гидратации и уравновешивания. Используйте гели для посадки клеток немедленно или храните в холодильнике до двух дней; здесь показана ожидаемая зависимость модуля Юнга от нескольких концентраций акриламида и бисакриламида, обозначенных соответственно как A и B.

Как модуль накопления G', так и модуль потерь G'' не зависят от частоты. Также было подтверждено, что высушивание с последующей регидратацией гелей не влияет на их модуль Юнга. С помощью сшивающего агента сулосампа можно добиться равномерного коллагенового покрытия гидрогелей любой жесткости.

Было отмечено, что при посеве на полиакриламидные гели в течение 24 часов клетки рака молочной железы M-D-A-M-B 2 31 оставались округлыми на мягких гелях с жесткостью 0.5 и 1 килопаскаль, но смогли распластаться и удлиниться на жестком геле с жесткостью 100 килопаскаль. Кроме того, гидрогели, созданные на гибкой пластиковой подложке, прозрачны и позволяют легко осуществлять визуализацию и микроскопию. Более того, гибкая пластиковая подложка не обладает автофлуоресценцией и, следовательно, не мешает получению изображений флуоресцентно меченых клеток.

Морфология клеток была дополнительно количественно оценена по общей площади распластывания клеток и их округлости. После просмотра этого видео у вас должно возникнуть четкое представление о том, как эффективно и недорого создавать полиамидные гели в формате многолуночного планшета для изучения клеточной биологии в зависимости от жесткости субстрата.