Простой основе полиакриламида многолуночные Жесткость Анализ по изучению жесткости зависимых клеточных ответов

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы обеспечить быстрое, эффективное и недорогое получение полиакриламидных гелей в формате многолуночных планшетов. Это достигается путем предварительного сэндвича, раствора предшественника геля между стеклянной пластиной с гидрофобным покрытием и эластичной пластиковой опорой с акриламидным клеем. Второй шаг заключается в том, чтобы снять гель со стеклянной пластины, которая ковалентно прилипла к гибкой пластиковой опоре после полимеризации, и дать ей высохнуть.

Затем сухой гель и лежащая под ним гибкая пластиковая основа разрезаются желаемой формы и приклеиваются пластиковой стороной вниз к дну луночного планшета или любого другого сосуда для клеточных культур. Заключительным этапом является покрытие полиакриламидных гелей, собранных на многолуночных планшетах, клеточным адгезивным покрытием, таким как монослой коллагена первого типа. В конечном счете, микроскопия, а также другие методы характеризации клеток используются для наблюдения за эффектом лежащей в основе полиакриламидной подложки.

В частности, его жесткость по отношению к поведению клеток. Основное преимущество этого метода перед существующими методами заключается в том, что он позволяет работать с полигелями любой жесткости и толщины, а также с их сборкой в формате многолуночной пластины с низкими затратами и временем, чего не позволяют другие методы. Демонстрация процедуры будет проводиться в качестве студента в моей лаборатории.

Сначала приготовьте раствор прекурсора полиакриламидного геля, смешав акриламид, сшивающий бисшивающий акриламид и деионизированную воду, растворите Sul OPA в диметилсульфоксе в концентрации 50 миллиграммов на миллилитр. Разложите 20 микролитров исходного раствора в 10 микроцентрифужных пробирках. Затем вспышкуйте, заморозьте растворы в жидком азоте и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Затем растворите аммоний на сульфат в деионизированной воде, чтобы получить конечную концентрацию аммония на сульфат 10% по объему. Выведите 25 микролитров раствора сульфата аммония в 10 микроцентрифужных пробирок и храните его при температуре минус 20 градусов Цельсия. Приготовьте 0,2 миллиграмма на миллилитр раствора коллагена, разбавив стоковый раствор коллагена одного типа в одном XPBS при pH 7,4.

Все растворы выдерживаются на льду до момента использования. На этом этапе нанесите несколько капель гидрофобного раствора на стеклянную пластину и с помощью папиросной бумаги распределите по поверхности. Дав пластине высохнуть на воздухе, снова протрите папиросной бумагой, чтобы выровнять гидрофобное покрытие.

Вырежьте гибкую пластиковую опору, чтобы она соответствовала размеру стеклянной пластины с гидрофобным покрытием. Затем отметьте гидрофобную сторону гибкой пластиковой основы, слегка поцарапав поверхность острым инструментом, таким как скальпель. Для приготовления геля в коническую пробирку объемом 50 миллилитров добавить 4972,5 мкл раствора прекурсора полиакриламида нужной конечной концентрации.

Поместите трубку в камеру дегазации на 30 минут с открытой крышкой. После этого добавьте 25 микролитров ранее приготовленного раствора аммония на сульфатный раствор в гель-раствор DGAs для достижения конечной концентрации аммония на сульфат 0,05%Затем добавьте 2,5 микролитра TM me для достижения конечной концентрации TM ME 0,5%. Затем поместите силиконовые прокладки нужной толщины на гидрофильную сторону гибкой пластиковой опоры.

раствор геля пипеткой на гибкую пластиковую опору между прокладками и сэндвичем с помощью стеклянного предметного стекла с гидрофобным покрытием. Дав гелю полимеризоваться в течение 45 минут, снимите гибкую пластиковую основу с ковалентно прикрепленным полиакриламидным гелем сверху и установите гелевую сторону вверх для сушки на воздухе. После высыхания разрежьте полиакриламидный гель по желаемой форме.

Приготовьте примерно 500 микролитров полиметилсоана на 96-луночную пластину в соответствии с инструкциями производителя, чтобы приклеить гели на дно многолуночной пластины. Поместите небольшую каплю полиметилсоана в центр каждой лунки с помощью щипцов. Поместите по одному полиакриламидному гелю в каждую лунку с гибкой пластиковой опорой вниз.

После отверждения полидиметилсубоксана поместите небольшое количество предварительно приготовленной целлюлозной сампы в каждую лунку с помощью переводной пипетки и поворачивайте из стороны в сторону, чтобы равномерно покрыть поверхность геля. Поместите пластину лунки под ультрафиолетовую лампу высокой интенсивности на пять минут. Когда закончите, промойте гели PBS, чтобы удалить излишки виолончели.

Вслед за этой пипеткой примерно по 50 микролитров предварительно приготовленного раствора коллагена первого типа в каждую. Хорошо оставьте накрытую пластину при комнатной температуре не менее чем на два часа после промывки PBS для удаления излишков коллагенового раствора. Стерилизуйте гели под ультрафиолетовым светом в вытяжке для культуры тканей в течение двух часов.

Наконец, замочите гели в полной среде на ночь, чтобы увлажнить и сбалансировать. Используйте гели для посадки клеток сразу или храните в холодильнике до двух дней по модулю молодняка в зависимости от нескольких акриламидов и биса. Концентрации акриламида, обозначенные как А и В соответственно, показаны здесь, как и ожидалось.

Как простое число модуля накопления G, так и двойное простое число модуля потерь G не зависят от частоты. Также было подтверждено, что сушка и последующая регидратация гелей не влияют на модуль упругости их детенышей. С помощью Crosslinker Sulo sampa можно добиться равномерного коллагенового покрытия на гидрогелях любой жесткости.

Было замечено, что при посеве на полиакриламидные гели в течение 24 часов, клетки рака молочной железы M-D-A-M-B 2 31 оставались круглыми на мягких гелях массой 0,5 и 1 кг Паскаля, но были способны распространяться и удлиняться на жестком геле Паскаль массой 100 кг. Кроме того, гидрогели, изготовленные поверх гибкой пластиковой основы, прозрачны и позволяют легко визуализировать и проводить микроскопию. Кроме того, гибкая пластиковая основа не флюоресцирует автоматически и, таким образом, не мешает визуализации флуоресцентно меченых клеток.

Морфология клеток была дополнительно количественно определена с точки зрения общей площади распространения клеток и цикличности клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, насколько эффективно и недорого собрать полиамидные гели в формате многолуночной пластины. Для изучения зависимости от жесткости клеточной биологии.