Новый подход к сравнительному анализу мультибелковых комплексов на основе

Общая цель данной процедуры заключается в сравнительном анализе состава комплексов MultiPro в мембранах thal cord при различных условиях. Для этого сначала выделяют мембраны thal из клеток lamona, подвергнутых воздействию анаэробных условий. Затем мембраны th cord солюбилизируют и фракционируют на градиенте плотности сахарозы.

Затем равные объемы выбранных фракций смешивают и разделяют с помощью SDS-PAGE. В завершение полосы, окрашенные кумасси, подвергают трипсинолизу. В итоге образцы анализируют методом количественной масс-спектрометрии для изучения изменений в содержании белков между исследуемыми фракциями.

Основным преимуществом данного метода перед существующими подходами, такими как количественные протеомные исследования с использованием определенного количества белка, является то, что в нашем подходе объединяются и анализируются равные объемы фракционированных образцов. Это позволяет изучать поведение белков при миграции в градиенте и, более того, анализировать состав различных небелковых комплексов в мембране третьей группы. Что касается используемых штаммов: после культивирования устойчивых штаммов Chlamydomonas reinhardtii согласно текстовому протоколу, используйте стоковые растворы 2 M сахарозы, 10% beta-DM в воде и 0,5 M Tris pH 8,0.

Для подготовки следующих растворов для сахарозных градиентов плотности с целью создания градиентов в центрифужных пробирках размером 14 × 89 мм начните с медленного вливания 1 mL 1.3 М раствора, затем 1 mL 1.0 М раствора. После этого влейте по 2 mL растворов 0.85 М, 0.7 М, 0.65 М и, наконец, 0.4 М. Храните градиенты в холодильной комнате в течение ночи для создания анаэробных условий.

В культуры Chlamydomonas вставьте стеклянную пипетку в колбы с культурами и продувайте смесью Argonne в течение четырех часов при постоянном перемешивании и освещении для выделения мембран тилакоидов. После инкубации осадите клетки путем центрифугирования в течение пяти минут при 2 500 ×g и температуре 4 °C. Затем ресуспендируйте осадок клеток в 30 мл буфера H1.

Повторите центрифугирование и снова ресуспендируйте клетки в буфере H one для их разрушения, затем пропустите их через небулайзер при давлении азота 1 500 Pascals. Убедитесь, что расстояние между керамическим шариком и металлом достаточно мало для эффективного разрушения клеток.

Затем центрифугируйте клетки в течение семи минут при 2 500 ×g и 4 °C. Супернатант должен иметь светло-зеленый цвет. Если разрушение клеток прошло успешно, ресуспендируйте их в 50 мл буфера H2 и осадите центрифугированием в течение 10 минут при 32 800 ×g и 4 °C.

Затем, после ресуспендирования клеток в 10 миллилитрах буфера H three, используйте гомогенизатор Поттера для гомогенизации ресуспендированного осадка. Далее, для подготовки градиентов плотности сахарозы в талакорде, начните с 12 миллилитров клеток в буфере H three.

Затем медленно налейте слой 12 мл буфера H four, а затем добавьте 12 мл буфера H five. Используйте буфер H five для балансировки ротора и центрифугируйте градиенты в течение одного часа при 70 700 ×g. Извлеките полосы TH из градиентов и разведите их соответствующим объемом буфера H six.

Центрифугируйте клетки при 37 900 ×g в течение 20 минут при температуре 4 °C. Если осадок недостаточно плотный, добавьте больше буфера H6 на этапе центрифугирования. Затем ресуспендируйте.

Суспендируйте таламовые тяжи в небольшом объеме буфера H six для нанесения на градиент плотности сахарозы фотосистемы. Сначала рассчитайте количество таламовых тяжей, beta DM и буфера H six, необходимых для каждого градиента. Согласно этим рекомендациям, каждый градиент должен содержать 0.8 mg/mL хлорофилла в 0.9% beta DM, а буфер H six будет использоваться для доведения конечного объема до 700 µL.

Для сольватации тилакоидов подготовьте отдельные смеси тилакоидов с бета-DM и буфером H6 для каждого градиента. Инкубируйте образцы на льду в течение 20 минут, переворачивая пробирки каждые несколько минут для перемешивания. Затем центрифугируйте образцы при 14 000 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C.

Осадок должен быть небольшим и беловатым, а супернатант — темно-зеленым. Нанесите супернатант на градиентный баланс с буфером H six и центрифугируйте в ультрацентрифуге при 134 470 ×g в течение 14 часов при температуре 4 °C. После центрифугирования сфотографируйте градиенты, затем приступайте к фракционированию.

Используйте иглу, чтобы проколоть отверстие в нижней части пробирки, и соберите фракции в пробирки объемом 500 µL. Также возможен процесс с использованием 96-луночного планшета. Подготовьте образцы для SDS-PAGE, гель-дигестии и масс-спектрометрии в соответствии с текстовым протоколом, представленным здесь, используя результаты иммуноанализа крови: фракцию 6 от дикого типа и фракцию 13 от delta PS1.

Для анализа компонентов суперкомплекса циклического транспорта электронов на данном рисунке были выбраны пиковые фракции A и R one. Показаны относительные соотношения белков дикого типа к delta PS one 14 N / 15 N для нескольких основных белков PS one и светособирающих белков PS one, а также для белков, отнесенных к суперкомплексу циклического транспорта электронов; различия в содержании a NR one и CAS во фракциях 6 и 13 дикого типа и delta PS one позволяют предположить, что они являются новыми компонентами этого комплекса. Здесь представлены результаты количественного сравнения этого суперкомплекса циклического транспорта электронов между диким типом и нокаутным штаммом PG L one. Интересно, что HCF 1 36, цитохром B six, субъединица 4 цитохрома B six F и PET C, по-видимому, обогащены в диком типе, в то время как FTSH two, цитохром F и PET O, по-видимому, обогащены в PG L one.

После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как сравнивать состав комплексов MultiPro в жидких мембранах при различных условиях. Имейте в виду, что для успешного приготовления жидких мембран и выделения циклического электронного транспорта критически важными этапами являются разрушение суперкомплексов клеток, гомогенизация клеток и стабилизация жидких мембран. Кроме того, центрифугирование градиентов плотности сахарозы должно продолжаться не менее 12 часов для достижения полного разделения фотосинтетических комплексов.