Новый подход к сравнительному анализу мультибелковых комплексов на основе ¹⁵ N Метаболический Маркировка и количественный Масс-спектрометрия

Общая цель этой процедуры заключается в сравнительном анализе состава комплексов MultiPro в мембранах талькордного мозга в различных условиях. Это достигается путем выделения таловых мембран из клеток ламоны, подвергшихся воздействию анаэробных условий. Затем мембраны шнура растворяются и фракционируются по градиенту плотности сахарозы.

Затем равные объемы желаемых дробей смешиваются и разделяются на странице SDS. Наконец, испачканные полосы кумаси перевариваются трипсином. В конечном счете, образцы анализируются с помощью количественной масс-спектрометрии, чтобы наблюдать изменения в распространенности белка между исследуемыми фракциями.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как количественные протеомные исследования, сравнивающие определенное количество белка, заключается в том, что в нашем подходе равные объемы фракционированных образцов объединяются и анализируются. Это позволяет изучать миграционное поведение белков в пределах градиента, а также анализировать состав различных небелковых комплексов в мембране третьей группы. В отношении применяемых штаммов После культивирования хламидомонады обуздайте выносливые штаммы, согласно текстовому протоколу, используйте стоковые растворы двух моляров сахарозы, 10% бета ДМ в воде и 0,5 моляра трижды pH 8,0.

Для приготовления следующих растворов для градиентов плотности сахарозы для настройки градиентов с помощью центрифужных пробирок размером 14 на 89 мм начинают с медленного вливания одного миллилитра 1,3 молярного раствора, а затем одного миллилитра 1,0 молярного раствора. Затем налейте по два миллилитра по 0,85, 0,7, 0,65 и, наконец, 0,4 молярных раствора. Храните градиенты на ночь в холодильной камере, чтобы вызвать анаэробные условия.

В культурах хламидомонады вставьте стеклянную пипетку в колбы для культивирования и пузыритесь с помощью Аргонны в течение четырех часов при непрерывном перемешивании и освещении для выделения мембран талового шнура. После инкубации начните с гранулирования клеток в течение пяти минут при 2500-кратном давлении и четырех градусах Цельсия. Затем ресуспендируют клеточные гранулы в 30 миллилитрах Н одного буфера.

Повторите центрифугирование и снова восстановите. Подвесьте клетки в Н по одному буферу, чтобы разбить клетки, пропустите их через небулайзер с давлением азота 1,500 Паскаля. Следите за тем, чтобы расстояние между керамическим шариком и металлом было достаточно маленьким, чтобы ячейки могли сломаться.

Затем вращайте ячейки в течение семи минут при скорости в 2500 раз сильнее силы тяжести и четырех градусах Цельсия. Надосадочная жидкость должна быть светло-зеленого цвета. Если поломка клеток прошла успешно, резонатор суспендирует клетки в 50 миллилитрах водорода в двух буферах и гранулирует их в течение 10 минут при температуре 32, 800 раз сильнее силы тяжести и четырех градусах Цельсия.

Затем, после суспензии клеток в 10 миллилитрах H 3 буфера, используйте гончар для гомогенизации ресуспендированного нёба. Далее подготавливаем шнур сахарозы градиентов плотности. Начните с 12 миллилитров клеток в H трех буферах.

Затем медленно налейте слой 12 миллилитров буфера H four и в завершение добавьте 12 миллилитров буфера H five. Используйте H 5 для балансировки ротора и центрифугируйте градиенты в течение одного часа при силе тяжести в 70, 700 раз. Удалите полосы TH из градиентов и используйте буфер соответствующего объема H six для их разбавления.

Вращайте ячейки со скоростью 37, 900 раз сильнее силы тяжести в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Если гранула не плотная, добавьте еще H six буфера на этапе центрифугирования. Затем ресус.

Подвесьте тальшнуры в небольшом объеме H шесть буфера, чтобы загрузить фотосистему с градиентом плотности сахарозы. Во-первых, рассчитайте количество тал канадов, бета ДМ и буфера H six, необходимых для каждого градиента. Следуя этим рекомендациям, каждый градиент будет содержать 0,8 миллиграмма на миллилитр хлорофилла в 0,9% бета-сухого вещества, а H six Buffer доведет конечный объем до 700 микролитров.

Для солюбилизации тиса приготовьте отдельную Eloqua с Thylakoids beta DM и буфером H six для каждого градиента. Инкубируйте образцы на льду в течение 20 минут и переворачивайте каждые несколько минут для перемешивания. После центрифугирования образцов при 14 000-кратном течении силы тяжести в течение 10 минут и четырех градусов Цельсия.

Гранула должна быть мелкой и беловатой, а надосадочная жидкость будет темно-зеленой. Загрузите надосадочную жидкость на градиентные балансы с помощью буфера H six и ультрацентрифуги при 134, 470-кратном давлении в течение 14 часов и четырех градусов Цельсия. После отжима сфотографируйте градиенты, которые затем нужно фракционировать.

С помощью иглы проколите отверстие на дне пробирки и соберите фракции в пробирки объемом 500 микролитров. Или 96-луночный планшетный процесс. Образцы для страницы SDS в гелеобразном разложении и масс-спектрометрии в соответствии с текстовым протоколом, как показано здесь, с использованием результатов иммунологического анализа крови фракции 6 от дикого типа и фракции 13 от дельта PS 1.

Для анализа циклических электронных потоков сверхсложных компонент на этом рисунке выбраны пиковые доли A и R. Показаны относительные соотношения белков, изображенных как дикий тип над дельта PS one, 14 N над 15 N для нескольких PS, одного ядра и светособирающих белков PS one, а также для белков, назначенных суперкомплексом с циклическим потоком электронов, показаны различия в распространенности NR и CAS в фракциях 6 и 13 дикого типа и дельта PS 1 позволяют предположить, что они являются новыми компонентами этого комплекса вот результаты количественного сравнения этого суперкомплекса с циклическим потоком электронов между диким типом и нокаутной деформацией PG L one. Интересно, что HCF 1 36, цитохром B 6, цитохром B 6, F субъединица 4 и ПЭТ С, по-видимому, обогащены в диком типе, в то время как FTSH два, цитохром F и ПЭТ О, по-видимому, обогащены в PG L.

После просмотра этого видео у вас будет хорошее понимание того, как сравнивать состав комплексов MultiPro в жидких мембранах в разных условиях. Следует иметь в виду, что для успешного приготовления жидких мембран и выделения циклического потока электронов критически важными этапами являются сверхсложные разрушения клеток, переливание клеток и их структурирование жидких мембран. Кроме того, градиенты плотности сахарозы необходимо центрифугировать в течение не менее 12 часов для достижения полного разделения фотосинтетических комплексов.