Протокол для идентификации белок-белковых взаимодействий на основе ¹⁵ N Метаболический маркировки, Иммунопреципитация, Количественный масс-спектрометрии и Affinity модуляции

Общей целью данного эксперимента является идентификация белков, специфически взаимодействующих с данным белком-мишенью в клеточных экстрактах, содержащих растворимые и мембранные белки. Во-первых, добиться полного метаболического мечения клеток хламидомона азотом 14 и азотом 15 и получить клеточные лизаты, содержащие и отсутствующие TP. Дополнительный этап сшивания помогает стабилизировать переходные белковые взаимодействия. Далее разделяют клеточные лизаты на фракции, обогащенные нерастворимыми и мембранными белками, из которых является целевой белок, его специфические партнеры по взаимодействию.

Контрольный белок и загрязняющие белки иммуноосаждаются и намекаются. Теперь смешайте иммуноосацитываемые белки и трижды переварите и проанализируйте их с помощью тандемных LCMS. Результаты различали истинных и ложных партнеров по взаимодействию, показывая различные соотношения азота, азота 14 и пептидов 15 для белков, специфически взаимодействующих с белком-мишенью, и равного азота.

14 Соотношение азота и 15 пептидов для целевого белка, контрольного белка и загрязняющих белков. Методом выбора для анализа белковых взаимодействий является иммуноосаждение выбранного белка непосредственно с его взаимодействием. Партнеры из клеточных экстрактов, где оба происходят в их нативном подтверждении и концентрации.

Однако при этом также осаждаются загрязняющие белки, главным образом потому, что они взаимодействуют с антителами, используемыми в современных масс-спектрометрах, чрезвычайно чувствительны. Они также однозначно идентифицируют загрязняющие белки, и таким образом невозможно отличить виновных партнеров от истинных партнеров по взаимодействию. Эта проблема решается с помощью показанной здесь методики, которая основана на метаболической мечке 15 N, иммунопреципитации, аффинной модуляции, здесь опосредованной состоянием A TP и количественной масс-спектрометрией.

Методика будет показана Стефаном Ш. Ш. Малинджером, старшим аспирантом в моей лаборатории. После мечения клеток в течение 10 поколений переносят по две аликвоты азота 14 и азота 15 меченых хламидомонадных клеток в 4G SA пробирки, собирают методом центрифугирования Resus, суспензируют гранулы в двух миллилитрах ледяного лизисного буфера и переносят суспензии в 15 миллилитровые пробирки Falcon собирают оставшиеся клетки с дополнительным одним миллилитром лизисного буфера каждая на каждую Eloqua. Добавьте 50 микролитров 25-кратного ингибитора протеазы и 12,5 микролитров одного молярного образца ультразвука хлорида магния четыре раза по 20 секунд на лед для полной клетки ISIS с 22-м перерывом между ними для охлаждения.

Приготовьте четыре шестимиллилитровые подушки сахарозы в тонкостенных пробирках SW 41 TI. Аккуратно уложите весь объем клеточных лизатов на подушки из сахарозы. Баланс с помощью лизиса, буфера и центрифуги для отделения растворимых белковых комплексов от мембран.

Перенесите растворимые белковые комплексы с вершины градиента в четыре 15-миллилитровые соколиные пробирки. Следите за тем, чтобы не перекладывать части подушки из сахарозы. Затем к каждому образцу добавляют 10% Тритона Х 100 до конечной концентрации 0,5%Тщательно перемешивают и добавляют буфер для лизиса до общего объема семь миллилитров.

Для SDS страница и иммунологические анализы крови. Отложите 70 микролитров каждого растворимого клеточного экстракта в свежую коническую пробирку объемом 1,5 миллилитра и добавьте 70 микролитров двух буферов для образцов XSDS. Затем выбросьте сахарозные подушки из тонкостенных пробирок SW 41 TI и добавьте в каждую гранулу по три миллилитра буфера для лизиса.

Добавьте один миллилитр 10% триттона X 100 до конечной концентрации 2%После растворения каждой гранулы методом ультразвука добавьте буфер для лизиса до общего объема пять миллилитров и центрифугуйте. Как и раньше, собирайте верхние фракции мембранных белковых комплексов в 15-миллилитровые соколиные пробирки. Добавьте буфер для лизиса, содержащий 2% триттона X 100, до конечного объема в семь миллилитров.

Используйте 70 микролитров этих образцов для SDS и иммунологических анализов крови. Сначала уравновесьте белок, связанный с антителами. Серобусины с двумя четырехмиллилитровыми смывками лизиса разбавляют до восьми миллилитров и аликвотируют.

Один миллилитр суспензии в каждую из восьми 15-миллилитровых пробирок сокола, содержащих растворимые или мембранные белковые комплексы из изобилующих ТП клеток азота 14 и азота 15, инкубируют в течение двух часов при четырех градусах Цельсия на валике трубки для осаждения белковых комплексов, гранулирования шариков методом центрифугирования, Выбросьте надосадочную жидкость, оставив небольшой объем жидкости поверх бусин, чтобы предотвратить загрязнение от белков, прилипших к пластиковым стенкам. Переложите образцы в свежие конические пробирки объемом 1,5 миллилитра, чтобы собрать все оставшиеся бусины в соколиных пробирках. Добавьте еще 0,8 миллилитров лизисного буфера, содержащего 0,1% триттона, в каждый вихрь, аккуратно центрифугируйте и перенесите буфер с остатками гранул в пробирки Эйнора После нескольких этапов промывки центрифугируйте образцы в течение 15 секунд при 16, 100 G и четырех градусах Цельсия.

Сначала удалите пробу надосадочной жидкости с помощью обычной пипетки. Затем полностью удалите остатки надосадочной жидкости с помощью шприца Hamilton объемом 50 микролитров. К каждому образцу добавьте 100 микролитров свежеприготовленного элюирующего буфера и инкубируйте в термомиксере при 800 об/мин центрифугируйте образцы в течение 15 секунд при 16, 100 G и 25 градусах Цельсия.

Теперь переложите каждую надосадочную жидкость в свежую пробирку с помощью чистого шприца Hamilton объемом 50 микролитров. Также добавьте 50 микролитров элюирующего буфера в процесс гранул, как и в случае с образцами ранее, и объедините соответствующие элаты. Не забудьте зарезервировать 30 микролитров всех образцов ЭИТ для SDS и иммунологических анализов крови.

Теперь соедините ускользающие осадки из плюса и минуса А TP обработанного азота 14 и азота 15 меченых растворимых и мембранных белков. Затем проводят восстановительное алкилирование и начальное расщепление с высоким содержанием мочевины, как описано в сопроводительной рукописи. Приступайте к дайджесту триптиха на вращающемся колесе не менее 16 часов.

При 37 градусах по Цельсию. Гранулируйте трипсин с помощью пятиминутного центрифугирования при температуре 16, 100 G и четырех градусах Цельсия. Переложите надосадочную жидкость в свежие двухмиллилитровые эйноровые трубки.

Промойте старые пробирки 50 микролитрами 20 миллимолярного бикарбоната аммония, 0,5% уксусной кислоты и смочите с первыми надосадочными веществами. Для того чтобы приготовить самодельные наконечники С 18 для обессоливания образцов, вырежьте иглой шприца два диска из материала эмкор С 18 и вставьте их в наконечник для пипетки объемом 200 микролитров. Затем проделайте отверстия в крышках четырех двухмиллилитровых пробирок эйнора и вставьте наконечники предварительно подготовьте наконечники C 18 stage 50 микролитрами раствора B центрифуги в течение трех минут при 800 G и 25 градусах Цельсия.

Далее уравновесьте наконечники ступени C 18 со 100 микролитрами раствора, центрифугой в течение трех минут при 800 G и 25 градусах Цельсия. Повторите этот шаг уравновешивания еще раз. Загрузите 100 микролитров образцов надосадочной жидкости из разложений триптихов на центрифугу C 18 stage tips в течение трех минут при 800 G и 25 градусах Цельсия.

Повторите загрузку колонки для полного нанесения проб надосадочной жидкости. После промывки наконечников ступени C 18 разбавьте триптические пептиды в свежую пробирку эйнора объемом 1,5 миллилитра с 50 микролитрами раствора центрифуги B в течение трех минут при 800 G и 25 градусах Цельсия. Повторите элуцианский шаг один раз, а затем высушите пептиды до конца в скоростном VAC reus.

Суспензировать высушенные пептиды в 20 микролитрах раствора А и инкубировать не менее одного часа на льду, прервав двумя 15-минутными инкубациями в центрифуге для ультразвуковой ванны в течение 20 минут при 16, 100 G и четырех градусах Цельсия и нанести Сенну в нано-C-M-S-M-S HSP 70. Известно, что белки теплового шока взаимодействуют со специфическими cos-шаперонами и субстратами только в отсутствие TP в этих азотных 14 меченых клеточных экстрактах hs P 70 B и CGE one почти исключительно локализованы в растворимой фракции независимо от состояния A TP. В отличие от этого, CF one beta локализован как в растворимых, так и в обогащенных мембранами фракциях.

Поскольку ультразвук срезает часть CF one beta с мембраны, расположенной A TP Synthes, он служит в качестве регулятора нагрузки для обеих фракций. Аналогичные количества H HSP 70 B осаждали с антителами против HSP 70 B из растворимых экстрактов, меченных азотом 14 и азотом 15, независимо от состояния A TP. Напротив, низкие уровни белка HS P 70 B, выпавшие в осадок из мембранных фракций, с несколько большими количествами, происходящими из TP, обеднили мембранные фракции по сравнению с TP в качестве ожидаемого сродства CGE E one для hs.

P 70 B зависит от контекста. Ни один из них не осаждался совместно с HS P 70 B.In изобилующей растворимыми или мембранными фракциями TP. Количества CGE одного белка, осажденного с HS P 70 B из обедненных TP растворимых фракций и TP обедненных мембранных фракций, количественно коррелируют с количеством осажденного HSP 70 B. Взаимодействие CGE one с HS P 70 B только в состоянии A DP также наблюдается при анализе методом масс-спектрометрии.

В этом эксперименте были приготовлены осадки для смесей азота 14 меченых экстрактов без ТП и азота, 15 меченых экстрактов с содержанием А ТП. В то время как тяжелая и легкая меченые формы пептида HS P 70 B были обнаружены с одинаковой интенсивностью, была обнаружена только легкая меченая форма пептида CGE One из обедненных экстрактов A TP. Здесь показаны те же пептиды из преципитата анти HS P 70 D DB, полученного из смесей взаимно меченых растворимых клеточных экстрактов. Соответственно, была обнаружена только тяжелая меченая форма пептида CGE One в обедненных экстрактах TP, а также как легкие, так и тяжелые меченые пептиды HSP 70 B.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее впечатление о том, как проводить эксперимент по осаждению в стране с пробоподготовкой для масс-спектрометрического анализа. Не забывайте, что загрязнение человеческим белком, особенно кератином, помешает вашим профилактическим измерениям в масс-спектрометре, поэтому меры предосторожности, такие как перчатки, чистая окружающая среда и области класса LCMS, имеют решающее значение при выполнении этой процедуры.