Протокол для идентификации белок-белковых взаимодействий на основе

Общая цель следующего эксперимента заключается в идентификации белков, специфически взаимодействующих с заданным белком-мишенью в клеточных экстрактах, содержащих растворимые и мембранные белки. Сначала проводят полную метаболическую маркировку клеток chlamydomonas азотом 14 и азотом 15, после чего готовят клеточные лизаты, содержащие и не содержащие TP. Дополнительный этап кросс-линкинга помогает стабилизировать транзиторные белок-белковые взаимодействия. Затем клеточные лизаты разделяют на фракции, обогащенные нерастворимыми и мембранными белками, из которых выделяют белок-мишень и его специфические партнеров по взаимодействию.

Контрольный белок и contaminating-белки подвергаются иммунопреципитации и элюированию. Затем смешайте иммунопреципитированные белки, проведите тройное переваривание и проанализируйте их с помощью тандемной LCMS. Результаты позволили отличить истинные партнеры по взаимодействию от ложных, продемонстрировав различные соотношения азота 14N и 15N в пептидах белков, специфически взаимодействующих с целевым белком, и равное содержание азота для остальных.

Отношения изотопов азота 14N и 15N для целевого белка, контрольного белка и белков-загрязнителей. Предпочтительным методом анализа белок-белковых взаимодействий является иммунопреципитация выбранного белка непосредственно вместе с его партнерами по взаимодействию из клеточных экстрактов, где оба компонента находятся в своей нативной конформации и концентрации.

Однако при этом выпадают в осадок и загрязняющие белки, главным образом из-за их взаимодействия с используемыми антителами, поскольку современные масс-спектрометры обладают чрезвычайно высокой чувствительностью. Они однозначно идентифицируют и загрязняющие белки, что делает невозможным разграничение ложных и истинных партнеров по взаимодействию. Эта проблема решается с помощью метода, представленного здесь, который основан на иммунопреципитации с метаболическим мечением 15 N, аффинной модуляции, опосредованной в данном случае состоянием ATP, и количественной масс-спектрометрии.

Метод будет продемонстрирован Штефаном Ш. Малингером, старшим аспирантом моей лаборатории. После мечения клеток в течение 10 поколений перенесите по две аликвоты клеток Chlamydomonas, меченных азотом 14 и азотом 15, в пробирки 4G SA, затем соберите их центрифугированием. Ресуспендируйте осадки в двух миллилитрах ледяного лизирующего буфера и перенесите суспензии в 15-миллилитровые пробирки Falcon; соберите оставшиеся клетки, добавив в каждую аликвоту еще по одному миллилитру лизирующего буфера. Добавьте 50 µL 25-кратного раствора ингибитора протеаз и 12,5 µL 1 M хлорида магния. Обработайте образцы ультразвуком четыре раза по 20 секунд на льду для полного лизиса клеток, делая 20-секундные перерывы для охлаждения.

Приготовьте четыре сахарозные подушки объемом 6 мл в тонкостенных пробирках SW 41 TI. Осторожно нанесите весь объем клеточных лизатов на сахарозные подушки. Доведите объем до равновесия с помощью буфера для лизиса и центрифугируйте для отделения растворимых белковых комплексов от мембран.

Перенесите растворимые белковые комплексы из верхней части градиента в четыре фалькон-пробирки объемом 15 мл, стараясь не захватить части сахарозной подушки. Затем в каждый образец добавьте 10% Triton X 100 до конечной концентрации 0.5%. Осторожно перемешайте и добавьте лизирующий буфер до общего объема семь мл.

Для анализа крови с помощью SDS-ПАГ и иммуноанализа перенесите 70 µL каждого растворимого экстракта клеток в новую коническую пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 70 µL двухкратного (2X) буфера для образцов SDS. Затем удалите сахарозные подушки из тонкостенных пробирок SW 41 TI и добавьте по 3 мл буфера для лизиса к каждому осадку.

Добавьте один миллилитр 10% Triton X 100 до конечной концентрации 2%. После растворения каждого осадка с помощью ультразвуковой обработки добавьте лизирующий буфер до общего объема пять миллилитров и центрифугируйте. Как и прежде, соберите верхние фракции мембранных белковых комплексов в пробирки Falcon объемом 15 миллилитров. Добавьте лизирующий буфер, содержащий 2% Triton X 100, до конечного объема семь миллилитров.

Используйте по 70 µL этих образцов для SDS-ПАГ и иммуноанализа крови. Сначала уравновесьте белок, конъюгированный с антителом. Сферические частицы (sero beads) промойте дважды 4 мл лизисного буфера, доведите общий объем до 8 мл и разлейте по аликвотам.

По одному миллилитру суспензии переносят в каждую из восьми 15-миллилитровых фальконовских пробирок, содержащих растворимые или мембранные белковые комплексы из клеток, обогащенных или обедненных TP и меченных азотом 14 и азотом 15. Инкубируют в течение двух часов при 4 °C на роллере для пробирок для осаждения белковых комплексов. Осаждают гранулы путем центрифугирования, удаляют супернатант, оставляя небольшой объем жидкости над гранулами, чтобы предотвратить загрязнение белками, прилипшими к пластиковым стенкам. Образцы переносят в новые конические пробирки объемом 1,5 миллилитра, чтобы собрать все оставшиеся гранулы из фальконовских пробирок. В каждую пробирку добавляют еще 0,8 миллилитра лизирующего буфера, содержащего 0,1% Triton, перемешивают на вортексе, осторожно центрифугируют и переносят буфер с остаточными гранулами в пробирки Eppendorf. После нескольких этапов промывки образцы центрифугируют в течение 15 секунд при 16 100 ×g и 4 °C.

Сначала удалите супернатанты образцов с помощью обычной пипетки. Затем полностью удалите остатки супернатанта с помощью шприца Hamilton объемом 50 µL. К каждому образцу добавьте 100 µL свежеприготовленного элюирующего буфера и инкубируйте в термомиксере при 800 RPM, центрифугируя образцы в течение 15 секунд при 16 100 ×g и 25 °C.

Теперь перенесите каждую надосадочную жидкость в новую пробирку, используя чистый шприц Hamilton объемом 50 µL. Также добавьте 50 µL элюирующего буфера к гранулам, как и в случае с предыдущими образцами, и объедините соответствующие элюаты. Не забудьте оставить 30 µL всех образцов EIT для SDS-PAGE и иммуноанализа крови.

Теперь объедините элюированные осадки растворимых и мембранных белков, меченных азотом 14 и азотом 15, полученные из образцов с добавлением и без добавления A TP. Затем проведите восстановление, алкилирование и первичный переваривание с высокой концентрацией мочевины, как описано в сопроводительной рукописи. Перейдите к триптическому перевариванию на ротационном колесе в течение не менее 16 часов.

При 37 °C. Осадите гранулы с трипсином путем центрифугирования в течение пяти минут при 16 100 ×g и 4 °C. Перенесите супернатанты в новые пробирки типа Эппендорф объемом 2 мл.

Промойте старые пробирки 50 µL 20 mM бикарбоната аммония и 0,5% уксусной кислотой, затем объедините промывочные растворы с первыми супернатантами. Для изготовления самодельных C 18 наконечников для обессоливания образцов вырежьте с помощью иглы шприца два диска из материала emcor C 18 и вставьте их в наконечник дозатора объемом 200 µL. Затем проделайте отверстия в крышках четырех пробирок einor объемом 2 мл и вставьте в них наконечники; кондиционируйте наконечники с C 18 стадией, добавив 50 µL раствора B, и центрифугируйте в течение трех минут при 800 G и 25 °C.

Затем уравновесьте наконечники C 18, добавив 100 µL раствора, и центрифугируйте в течение трех минут при 800 G и 25 °C. Повторите этот этап уравновешивания еще раз. Затем нанесите 100 µL супернатантов образцов после триптического переваривания на наконечники C 18 и центрифугируйте в течение трех минут при 800 G и 25 °C.

Повторяйте нанесение на колонку до полного использования супернатантов образцов. После промывки наконечников с C 18 элюируйте трипсин-расщепленные пептиды в чистую пробирку-эппендорф объемом 1.5 мл, используя 50 µL раствора B; центрифугируйте в течение трех минут при 800 ×g и 25 °C. Повторите этап элюции один раз, затем полностью высушите пептиды в вакуум-концентраторе SpeedVac.

Растворите высушенные пептиды в 20 µL раствора А и инкубируйте не менее одного часа на льду, прерывая процесс двумя 15-минутными инкубациями в ультразвуковой бане и центрифугированием в течение 20 минут при 16 100 ×g и температуре 4 °C, затем нанесите Senna на nano C-M-S-M-S HSP 70. Известно, что белки теплового шока взаимодействуют со специфическими кошаперонами и субстратами только в отсутствие ATP; в этих экстрактах клеток, меченных азотом 14, hs P 70 B и CGE one локализованы почти исключительно в растворимой фракции независимо от состояния ATP. Напротив, CF one beta локализована как в растворимой, так и в обогащенной мембранной фракциях.

Поскольку соникация отрывает часть CF one beta от мембраны, расположенной в A TP Synthes, этот белок служит контролем нагрузки для обеих фракций. Схожие количества H HSP 70 B были осаждены с помощью антител к HSP 70 B из растворимых экстрактов, меченных азотом-14 и азотом-15, независимо от состояния A TP. Напротив, из мембранных фракций осаждалось низкое количество белка HS P 70 B, при этом количество белка из мембранных фракций, истощенных по a TP, было немного выше по сравнению с фракциями, насыщенными a TP, что соответствует ожидаемому сродству CGE E one к hs.

Связывание P 70 B зависит от контекста. Белок CGE one не соосаждался с HS P 70 B в растворимых или мембранных фракциях при достаточном содержании TP. Количество белка CGE one, соосаждаемого с HS P 70 B из растворимых фракций и мембранных фракций при дефиците TP, количественно коррелирует с количеством осажденного HSP 70 B. В ходе масс-спектрометрического анализа также наблюдается взаимодействие CGE one с HS P 70 B исключительно в состоянии A DP.

В данном эксперименте были подготовлены осадки для смесей экстрактов, меченых азотом 14 и лишенных A TP, и экстрактов, меченых азотом 15 и содержащих A TP. В то время как тяжело- и легкомеченые формы пептида HS P 70 B обнаруживались с равной интенсивностью, из экстрактов, обедненных A TP, была обнаружена только легкомеченая форма пептида CGE one. Здесь представлены те же пептиды из осадка anti HS P 70 D DB, полученного из смесей взаимно меченых растворимых клеточных экстрактов. Соответственно, в экстрактах, обедненных A TP, была обнаружена только тяжеломеченая форма пептида CGE one, а также обе формы (легко- и тяжеломеченые) пептидов HSP 70 B.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как проводить эксперимент по осаждению белков с подготовкой образцов для анализа методом масс-спектрометрии. Помните, что загрязнение белками человека, особенно кератином, создаст помехи при проведении профильных измерений на масс-спектрометре, поэтому при выполнении данной процедуры крайне важно соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток, работа в чистой среде и применение реагентов степени чистоты LCMS.