Легковесные протокол для синтеза самостоятельной сборки на основе амидов кислых пептидные Amphiphiles (ППД) и связанных с ними биоматериалов

Этот метод может ответить на ключевые вопросы о том, как декорировать пептидные амфифилы до полиаминов и об использовании восьмиугольных защитных групп. Демонстрировать процедуру будут Мехди, Наталия и Кришнайя, студенты лаборатории Конды Шеридан. Сначала тщательно взвесьте 2-хлортритилхлоридную смолу и поместите смолу в фриттированный, среднепористый, синтезаторный сосуд емкостью 50 миллилитров.

Затем прикрепите сосуд для синестеза к механическому встряхивателю с регулируемой скоростью и поверните сосуд под углом 45 градусов для максимального перемешивания. Затем добавьте в смолу 15 миллилитров DCM. Дав шарикам смолы набухнуть в течение 15 минут, добавьте в смолу восемь эквивалентов желаемого полиамина и дайте ему вступить в реакцию в течение пяти часов.

Через пять часов проведите тест Кайзера, чтобы подтвердить успешную реакцию полиамина на смолу. После этого защитите первичную аминную группу, добавив четыре эквивалента DDE в безводный метанол и встряхнув реакционную смесь на ночь. На следующий день проведите тест Кайзера, чтобы подтвердить успешную защиту по отсутствию синего цвета на шарике смолы.

Затем слейте воду из DCM и дважды промойте смолу смесью DCM и DMF в соотношении два к одному. Теперь добавьте в смолу 20 эквивалентов ангидрида Boc в DCM и дайте реакции протекать в течение трех часов. После проведения теста с хлоранилом для подтверждения защиты вторичного амина слейте смесь растворителя и дважды промойте смолу смесью ДКМП и ДМФА в соотношении два к одному.

После этого добавьте в смолу 10 миллилитров 2%-ного раствора гидразина в ДМФА. После встряхивания в течение одного часа проведите тест Кайзера, чтобы подтвердить успешное снятие защиты с первичного амина. Затем смешайте четыре эквивалента защищенной Fmoc аминокислоты, 3,95 эквивалента HBTU и 15 эквивалентов DIPEA.

Добавьте смесь DCM и DMF один к одному и обработайте коктейль ультразвуком до полного растворения. Убедитесь, что аминокислота, связующий агент и DIPEA действительно смешаны и активированы, прежде чем добавлять смесь в смолу. Подождав от трех до пяти минут, чтобы убедиться в активации карбоновой кислоты, добавьте реакционную смесь в сосуд, содержащий смолу, и дайте реакции протекать в течение двух-четырех часов при температуре окружающей среды.

Проводите тест с кайзером или хлоранилом на каждом этапе, чтобы подтвердить успешное соединение. После проведения теста Кайзера для подтверждения успешного связывания снимите защиту группы Fmoc от аминокислоты, добавив 10 миллилитров 20% раствора 4-метилпиридина в ДМФА. После завершения реакции проведите тест Кайзера, чтобы подтвердить успешное снятие защиты с аминокислоты.

Затем дважды промойте смолу 10 миллилитрами DMF, каждая промывка в течение 5 минут, и, наконец, 10 миллилитрами DCM в течение 10 минут. После соединения всех необходимых аминокислот конъюгируйте гидрофобный хвост с последней аминокислотой, добавив 10 эквивалентов желаемой функциональности карбоновой кислоты к 9,5 эквивалентам HBTU и 12 эквивалентам DIPEA. Обработайте коктейль ультразвуком до полного растворения, затем добавьте коктейль в сосуд.

Проводите реакцию не менее пяти часов, хотя для получения наибольшего урожая желательно проводить ее на ночь. Промойте смолу восемью миллилитрами ДМФА в течение двух минут, и дважды восемью миллилитрами ДКМП в течение пяти минут. Перед каждым добавлением сливайте растворитель из сосуда.

После того, как будет выполнена последняя стирка, просушите смолу под вакуумом в течение 15 минут. Чтобы приготовить 15 миллилитров коктейля для расщепления, добавьте 14 миллилитров ТЖК на 0,5 миллилитра воды и 0,5 миллилитров триизопропилсилана. Добавьте этот коктейль из расщепления в смолу и взбалтывайте в течение двух-четырех часов при комнатной температуре.

После того как реакция расщепления завершится, соберите раствор в колбу с круглым дном объемом 50 миллилитров. Затем сконцентрируйте ТФК в вакууме до одного-двух миллилитров с помощью ротационного испарителя при пониженном давлении, нагревая смесь до 40 градусов Цельсия После выпаривания добавьте полученный раствор ТФК по каплям в круглую донную колбу, содержащую 15 миллилитров безводного холодного эфира для осаждения ППА. Далее добавьте 5 миллилитров безводного эфира холода в исходную колбу, содержащую концентрированный раствор ТФК.

Обработайте ультразвуком для извлечения дополнительных твердых веществ. Затем объедините с эфирным раствором из предыдущего шага. Накройте колбу крышкой и поставьте ее в холодильник на ночь, чтобы выпало максимальное количество осадков.

На следующий день соберите осажденный материал с помощью вакуумной фильтрации с помощью центральной дисковой фильтрующей воронки мелкого или среднего размера. Наконец, дважды промойте осадок пятью-десятью миллилитрами холодного эфира, чтобы удалить остатки органики. След ВЭЖХ и MALDI Spectrum подтверждают наличие продукта PPA, который должен иметь чистоту более 95% для определения характеристик материала или биологической оценки.

В следе ВЭЖХ на основе УФ-излучения наблюдается один резкий пик, а спектр MALDI соответствует спектру рассчитанной молекулярной массы PPA в пределах плюс-минус одной дальтоны. Самосборка PPA может быть визуализирована и проанализирована с помощью просвечивающей электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии, малоуглового рентгеновского рассеяния, сканирующей электронной микроскопии и динамического рассеяния света. Успешная самосборка приведет к созданию хорошо определенных наноструктур, как в просвечивающей электронной микроскопии, так и в атомно-силовой микроскопии.

После освоения этого протокола его можно выполнить за три дня при правильном выполнении. Пытаясь пройти эту процедуру, не забудьте очистить продукты и оценить их чистоту перед любыми последующими исследованиями. После этой процедуры можно получить другие молекулы, такие как пептидные амфифилы, пептиды и пептидно-полиаминовые гибриды.

После своего развития этот метод помогает исследованиям в области самосборки пептидных амфифилов для изучения влияния полиаминовых наноструктур в таких областях, как доставка лекарств, визуализация или катализ После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как проводить синтез пептидных амфифилов на основе полиаминов и родственных пептидных амфифилов. Трифторуксусная кислота и 4-метилпиридин могут быть опасными, поэтому при выполнении этой процедуры следует соблюдать такие меры предосторожности, как ношение перчаток, лабораторных халатов и работа в вытяжном шкафу.